SILAC用于蛋白質(zhì)組學(xué)定量

SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理2:應(yīng)用

2.1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)

2.2:SILAC研究蛋白質(zhì)相互作用

2.3：SILAC研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用

2.4：SILAC研究蛋白質(zhì)與RNA相互作用1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理1.1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)的原理1.2：SILAC技術(shù)流程

1.2.1：培養(yǎng)基準(zhǔn)備

1.2.2：細(xì)胞標(biāo)記與測(cè)試

1.2.3:實(shí)驗(yàn)處理

1.2.3：蛋白質(zhì)分離與質(zhì)譜分析

1.2.4：結(jié)果形式SILAC法。

1、標(biāo)記：在缺乏Lys和Arg的培養(yǎng)基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C615N4)、Arg(13C6,或13C615N4)等培養(yǎng)細(xì)胞，使蛋白質(zhì)被標(biāo)記成“中型”或“重型”；

2、細(xì)胞處理，如藥物處理；

3、細(xì)胞裂解、提取蛋白質(zhì)；

4、等量混合對(duì)照與處理組蛋白質(zhì)、SDS電泳、染色；

5、割取蛋白質(zhì)條帶，胰蛋白酶消化，質(zhì)譜分析。1.1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理1.1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)原理

技術(shù)優(yōu)勢(shì)——目前比較蛋白質(zhì)組學(xué)最先進(jìn)方法

（1）高效性：SILAC是體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記效率可高達(dá)100%；（2）定量精確：線性范圍廣，降低由于樣品制備不同而造成的實(shí)驗(yàn)內(nèi)差異；（3）高通量、靈敏度高：可同時(shí)鑒定并定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白質(zhì)，且檢可測(cè)測(cè)到納克級(jí)水平；（4）相容性：可以對(duì)多種在DMEM或RPMI1640培養(yǎng)基中能夠培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)的蛋白進(jìn)行標(biāo)記；（5）靈活性：在缺乏L-賴氨酸和L-精氨酸的培養(yǎng)基中添加同位素標(biāo)記的這兩種氨基酸，操作方便。1.2.1：培養(yǎng)基準(zhǔn)備材料：（1）：Lys或（和）Arg缺陷型1640培養(yǎng)基，Lys或（和）Arg缺陷型DMEM培養(yǎng)基。（2）：透析FBS。（3）：穩(wěn)定同位素標(biāo)記的Lys和Arg。L-Lysine(13C6),L-Lysine(13C6,15N2),L-Lysine(13C6,15N2),L-Lysine(15N2,D9),L-Lysine(4,4,5,5-D4),L-Arginine(13C6),L-Arginine(13C6,15N4),L-Arginine(13C6,15N4)。培養(yǎng)基制備：取相應(yīng)量的穩(wěn)定同位素氨基酸Lys和Arg各50mg,添加到500ml培養(yǎng)基中，同時(shí)添加血清（一般是10%）和抗生素后，0.22um濾膜過濾，4度保存?zhèn)溆?。根?jù)實(shí)驗(yàn)的需要，可以配制“中”型和“重”型培養(yǎng)基。

1.2.2：細(xì)胞標(biāo)記與測(cè)試標(biāo)記：一般細(xì)胞經(jīng)過添加同位素的培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)5-6代后，一天或2天傳代一次，細(xì)胞中蛋白質(zhì)的Lys和Arg將被同位素氨基酸取代。添加了穩(wěn)定同位素（“中”或“重”型）的細(xì)胞與“輕”型細(xì)胞相比細(xì)胞生長(zhǎng)速度可能偏慢，這是由于透析血清與中缺乏一些鹽成分，可以讓透析血清在PBS里面透析，透析膜的孔徑一般為10KDa.標(biāo)記測(cè)試：在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)之前，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記測(cè)試，測(cè)試細(xì)胞中蛋白質(zhì)的Lys和（或）Arg是否被相應(yīng)的同位素氨基酸取代。收取蛋白質(zhì)后，等量混合，SDS分離，LC-MS/MS檢測(cè)。1.2.2：細(xì)胞標(biāo)記與測(cè)試細(xì)胞經(jīng)過傳代培養(yǎng)7天后，同一肽段被“重”型肽段取代1.2.3:實(shí)驗(yàn)處理

當(dāng)標(biāo)記測(cè)試檢測(cè)到蛋白質(zhì)已被同位素氨基酸標(biāo)記后，可以進(jìn)行細(xì)胞處理，如藥物處理，病毒處理等。1.2.3：蛋白質(zhì)分離與質(zhì)譜分析（1）：提取“輕”型”，“中”型，“重”型細(xì)胞蛋白質(zhì)，等量混合，SDS分離，染色。（2）：割取蛋白質(zhì)條帶，胰蛋白酶酶切。（3）：LC-MS/MS（儀器：LTQOrbitrapXL?)分析，數(shù)據(jù)檢索。1.2.4：結(jié)果形式

LC-MS/MS分析結(jié)果，將會(huì)給出每個(gè)肽段的質(zhì)譜峰圖及定量信息。結(jié)果將會(huì)已EXCEL表格呈現(xiàn)。肽段質(zhì)譜峰圖及表達(dá)量：2:SILAC應(yīng)用2.1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)例

2.2:SILAC研究蛋白質(zhì)相互作用

2.3：SILAC研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用

2.4：SILAC研究蛋白質(zhì)與RNA相互作用2.1：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)例2.1SchematicforSILACSILAC實(shí)驗(yàn)流程圖2.1MSspectrashowingthefourmajorpatternsofphosphorylationobservedSILAC定量結(jié)果圖例，質(zhì)譜峰的高度表示蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度.SummaryoffoldchangewithHer2forall462proteins,withseveralindividualproteinshigh-lighted.Proteinswitharatio>1.5(upperredline)areconsideredasincreasedintheirtyrosinephosphorylationlevel,andthosewithratios<0.66(lowerredline)areconsideredasdecreasedintheirtyrosinephosphorylationlevel.

In3T3-Her2cells,198proteinsshowedsignificantincreasesinphosphorylation,and81proteinsshowedasignificantdecrease

2.1Quanti?cationofphosphorylationbySILAC2.1Conclusion2.2SILAC研究蛋白