核酸分子雜交-(1) - 副本

1分子生物學(xué)

MolecularBiology核酸的分子雜交NucleicAcidHybridizationDepartmentofbiochemistryandmolecularbiology2ContentofTable一、核酸的檢測二、核酸分子雜交技術(shù)的原理三、核酸探針的制備四、核酸探針的標(biāo)記五、核酸分子雜交技術(shù)3一、核酸的檢測包括DNA的質(zhì)量、大小、純度檢測4

凝膠電泳技術(shù)樣品的物理性質(zhì)分子大小、電荷、空間構(gòu)型支持物介質(zhì)瓊脂糖，100-60000bp,

聚丙烯酰胺，1-500bp電場強(qiáng)度，5V/cm緩沖液離子強(qiáng)度

TAE,TBE,TPE5操作過程6DNA分子大小的檢測NEB，1KbDNALadder：3kb=62.5ng，1kb=21.0ngPCR產(chǎn)物3Kb1Kb7一、核酸分子雜交技術(shù)的原理

有互補(bǔ)特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混在一起時，其相應(yīng)同源區(qū)段將會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如把一段已知基因（DNA或RNA）的核酸序列用合適的標(biāo)記物（如放射性同位素、生物素等）予以標(biāo)記，當(dāng)作探針（probe),

與變性后的單鏈基因組DNA或RNA等進(jìn)行雜交。用合適方法（如放射自顯影或免疫組織化學(xué)等技術(shù)）把標(biāo)記物檢測出來，就可確定靶核苷酸序列的拷貝數(shù)及表達(dá)豐度等。

8910DNA變性是指核酸雙螺旋堿基對的氫鍵斷裂，雙鏈變成單鏈，從而使核酸的天然構(gòu)象和性質(zhì)發(fā)生改變。變性時維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結(jié)構(gòu)的改變。凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，如加熱、極端的pH、有機(jī)試劑甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子變性。11溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的剛性結(jié)構(gòu)，變性后代之以柔軟而松散的無規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)，DNA粘度因此而明顯下降。溶液旋光性發(fā)生改變。變性后整個DNA分子的對稱性及分子局部的構(gòu)性改變，使DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。增色效應(yīng)。指變性后DNA溶液的紫外吸收作用增強(qiáng)的效應(yīng)。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基藏入內(nèi)側(cè)，變性時DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。12復(fù)性指變性DNA在適當(dāng)條件下,二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象,它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性,此過程稱之為"退火"(annealing)。這一術(shù)語也用以描述雜交核酸分子的形成。DNA的復(fù)性不僅受溫度影響,還受DNA自身特性等其它因素的影響。13

應(yīng)用：1）檢測特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系；2）用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。14二、核酸探針的制備探針（Probe):

一段帶有檢測標(biāo)記的與目的基因或目的DNA特異互補(bǔ)的已知核苷酸序列。15理想的探針1.要加以標(biāo)記、帶有示蹤物，便于雜交后檢測和鑒定雜交分子。2.應(yīng)是單鏈，若為雙鏈用前需要先行變性為單鏈。3.具有高度特異性，只與靶核酸序列雜交，不與樣本中存在的其它核酸雜交。4.探針長度一般是十幾個堿基不等，小片段探針較大片段探針雜交速率快。5.作為探針的核苷酸序列要選取基因編碼序列，避免用內(nèi)含子及其它非編碼序列。6.標(biāo)記的探針應(yīng)具有高靈敏度、穩(wěn)定，標(biāo)記方法簡便、安全。16(一）探針的分類據(jù)制備方法及核酸性質(zhì)不同，可分為：

基因組DNA探針（genomicprobe）

cDNA探針（cDNAprobe）

RNA探針（RNAprobe）寡核苷酸探針（oligonucleotideprobe)據(jù)探針標(biāo)記物的類型不同：同位素標(biāo)記的探針非同位素標(biāo)記的探針17

cDNA（complementaryDNA）是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。這種DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達(dá)的檢測。2、cDNAprobe18

采用基因克隆或體外轉(zhuǎn)錄的方法獲得。有些病毒的基因組是RNA，分離后經(jīng)適當(dāng)標(biāo)記可制成RNA探針。3、RNAprobe19三、核酸探針的標(biāo)記

為確定探針是否與相應(yīng)基因組DNA雜交，有必要對探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號。2021核酸分子雜交信號的檢測放射性同位素標(biāo)記探針：

放射自顯影。

非放射性同位素標(biāo)記探針：

偶聯(lián)反應(yīng)+顯色反應(yīng)。22四、核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交

固相雜交液相雜交印跡雜交原位雜交固相雜交：結(jié)合于某種固相支持物上的待測樣品與溶解于雜交液中的探針進(jìn)行的雜交。包括膜上印跡雜交、原位雜交。液相雜交：待測樣品和探針均溶于液體中進(jìn)行雜交反應(yīng)。23

此技術(shù)由Southern1975年首先設(shè)計。被檢測對象為DNA。

（一）Southern印跡雜交2425帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程2627Northernblot28

5、Southern雜交

⑴、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液。

⑵、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA

雜交，雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交。

⑶、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的DNA。31.（20分）圖1是一個常染色體遺傳病的家系系譜。致病基因（a）是由正?；颍ˋ）序列中一個堿基對的替換而形成的。圖2顯示的是A和a基因區(qū)域中某限制酶的酶切位點(diǎn)。、分別提取家系中Ⅰ1、Ⅰ2和Ⅱ1的DNA，經(jīng)過酶切、電泳等步驟，再用特異性探針做分子雜交，結(jié)果見圖3。

（1）Ⅱ2的基因型是_______________。（2）一個處于平衡狀態(tài)的群體中a基因的頻率為q。如果Ⅱ2與一個正常男性隨機(jī)婚配，他們第一個孩子患病的概率為_________。如果第一個孩子是患者，他們第二個孩子正常的概率為_____________。（3）研究表明，世界不同地區(qū)的群體之間，雜合子（Aa）的頻率存在著明顯的差異。請簡要解釋這種現(xiàn)象。①_____________；②____________。（4）B和b是一對等位基因。為了研究A、a與B、b的位置關(guān)系，遺傳學(xué)家對若干基因型為AaBb和AABB個體婚配的眾多后代的基因型進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些后代的基因型只有AaBB和AABb兩種。據(jù)此，可以判斷這兩對基因位于_________染色體上，理由是_______。（5）基因工程中限制酶的作用是識別雙鏈DNA分子的_________，并切割DNA雙鏈。（6）根據(jù)圖2和圖3，可以判斷分子雜交所用探針與A基因結(jié)合的位置位于_______?！敬鸢浮浚?）AA或Aa（2）

（3）不同地區(qū)基因突變頻率因環(huán)境的差異而不同不同的環(huán)境條件下，選擇作用會有所不同（4）同源基因AaBb個體只產(chǎn)生Ab、aB兩種類型配子，不符合自由組合定律（5）特定核苷酸序列（6）酶切位點(diǎn)①與②之間32（四）斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交Dotblottingandslotblotting原理：是將被檢標(biāo)本的RNA或DNA變性后直接點(diǎn)樣吸附于硝酸纖維膜上，然后用標(biāo)記探針與之雜交。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。

優(yōu)點(diǎn)：用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量分析，方法簡便、快速、靈敏、樣品用量少。缺點(diǎn)：不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽性。3334HPVFISH35菌落原位雜交

菌落原位雜交是將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將DNA烘干固定于膜上與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。3637菌落原位雜交下圖為通過DNA分子雜交鑒定含有某特定DNA的細(xì)菌克隆示意圖。下列敘述正確的是A根據(jù)培養(yǎng)皿中菌落數(shù)可以準(zhǔn)確計算樣品中含有的活菌實際數(shù)目B外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動子和終止子之間才能進(jìn)行復(fù)制C重組質(zhì)粒與探針能進(jìn)行分子雜交是因為DNA分子脫氧核糖和磷酸交替連接D放射自顯影結(jié)果可以顯示原培養(yǎng)皿中含有特定DNA的細(xì)菌菌落位置【答案】D【解析