第六章 食品發(fā)酵

第六章食品發(fā)酵

LOGO1.發(fā)酵和發(fā)酵食品的定義一、發(fā)酵廣義——通過微生物的培養(yǎng)使某種特定代謝產(chǎn)物或菌體本身大量積累的過程。狹義——厭氧微生物或兼性厭氧微生物在無氧條件下進行能量代謝并獲得能量的一種方式。

二、發(fā)酵食品廣義——凡是利用微生物作用制取的食品都稱為發(fā)酵食品狹義——人們利用有益微生物加工制造的一類食品，具有獨特的風(fēng)味2.發(fā)酵的分類1.代謝產(chǎn)物發(fā)酵2.酶制劑發(fā)酵3.菌體發(fā)酵4.生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵3.微生物對食品成分的作用類型1.阮解型阮解型微生物分解蛋白酶，將蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)分解生成胨、多肽、寡肽、氨基酸等產(chǎn)物，氨基酸可進一步轉(zhuǎn)化成為酸、醛、醇和其他無機小分子物質(zhì)如胺類、硫化氧、甲烷、氫氣等。2.脂解類脂解菌是能分解脂肪、磷脂和類脂物質(zhì)的微生物。通過脂酶的作用，將這些脂類降解成脂肪酸、甘油、醛、酮類化合物、CO2和水，使油脂酸敗，產(chǎn)生哈喇味和魚腥味等異味。3.糖類發(fā)酵型有些微生物（如部分霉菌和細菌）能合成和分泌糖酶，在細胞外催化淀粉逐漸水解成各種糊精、低聚糖、麥芽糖、葡萄糖。另一類不能直接水解大多數(shù)糖，原料必須經(jīng)過酶或其他微生物的作用使大多數(shù)分解成為簡單糖以后才能被細胞利用。4.食品發(fā)酵中的常用微生物一、醋酸桿菌屬（一）此菌為幼齡菌屬，革蘭氏陰性桿菌，無芽孢，需氧，能將乙醇氧化為醋酸。（二）主要作用于發(fā)酵糧食、腐敗的水果、蔬菜、變酸的酒類和果汁。二、乳酸桿菌此菌屬革蘭氏陽性菌，菌體呈桿狀，鏈狀排列。根據(jù)它利用葡萄糖進行同型發(fā)酵或異型發(fā)酵的特性分為同型發(fā)酵群和異型發(fā)酵群。常在乳制品和植物性發(fā)酵食品中發(fā)現(xiàn)。有嗜酸乳桿菌、乳酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌和干酪乳桿菌等。酵母菌（一）釀酒酵母又名啤酒酵母，為子囊菌綱，內(nèi)孢霉目。應(yīng)用于啤酒、白酒、果酒的釀造和面包的制造。由于菌體的維生素、蛋白質(zhì)含量高，也可作藥用和飼料酵母。分布于水果表面、發(fā)酵果汁、果園土壤和酒曲中。（二）球擬酵母球擬酵母屬半知菌綱，叢梗孢目，隱球酵母可，球擬酵母屬。有的菌種具有酒精發(fā)酵能力，能使葡萄糖轉(zhuǎn)化為多元醇，如在工業(yè)上利用糖蜜生產(chǎn)甘油。（三）面包酵母亦稱壓榨酵母、活性干酵母、新鮮酵母，用于面包發(fā)酵。制法是將純酵母移植于含糖的培養(yǎng)液中，大量通氣條件下，使之繁殖，再用高速離心機分離培養(yǎng)液中的酵母。（四）上面酵母酵母在液體基質(zhì)中培養(yǎng)時，許多增值的酵母細胞浮游于培養(yǎng)液上層，此就稱為上面酵母。下面酵母亦同。霉菌毛霉屬具有分解蛋白質(zhì)功能，用來制造腐乳，可使腐乳產(chǎn)生芳香物質(zhì)和蛋白質(zhì)分解物。某些菌種具有較強的活力，可用于酒精和有機酸的工業(yè)原料的糖化和發(fā)酵。

曲霉屬菌絲老熟后常呈黑、棕、黃、綠、紅等顏色。曲霉菌具有分解有機質(zhì)的能力，在釀造中常作為糖化菌種或者制作醬油。根霉屬用途廣泛，能產(chǎn)生淀粉酶，使淀粉轉(zhuǎn)化為糖，是釀酒工業(yè)常用的糖化菌，也引起食品及其制品霉變。紅曲霉屬能合成多種酶類，如淀粉酶、麥芽糖酶、蛋白酶、天然色素，及其他生理活性物質(zhì)，如檸檬酸、琥珀酸、乙醇，常用以釀酒、制醋、醬油、味精、肉制品和豆腐乳著色劑。5.發(fā)酵保藏的原理1.發(fā)酵產(chǎn)酸微生物發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸主要有乳酸、醋酸、檸檬酸等其他有機酸，從而降低食品的pH，提高了其儲藏性。2.發(fā)酵產(chǎn)乙醇乙醇除了具有調(diào)節(jié)和改善風(fēng)味的作用外，還可以抑制其他一些有害微生物的作用。乙醇濃度越高，抑制微生物的作用越強。3.抑制其他腐敗微生物的生長作為發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌，產(chǎn)生乙酸或酸的微生物在生長和代謝的同時消耗食品中的營養(yǎng)成分（尤其是碳源和氮源）有些微生物還能產(chǎn)生除酸和醇以外的其他抑菌物質(zhì)，如過氧化氫、二氧化碳、光譜抗生素（如羅伊式菌素）和細菌素（如乳酸鏈球菌素、大腸桿菌屬）等。6.發(fā)酵對食品品質(zhì)的影響1.質(zhì)地軟化2.營養(yǎng)價值和消化率提高3.食品的風(fēng)味和香味發(fā)生改變4.促進色澤的改變5.使產(chǎn)品具有益生作用1）.發(fā)酵用微生物及酶的益生作用2）.多肽與氨基酸的益生作用3）.多糖與低聚糖的益生作用4）.抗氧化活性物質(zhì)的益生作用5）.降膽固醇、降血壓物質(zhì)和其他物質(zhì)的益生作用6.形成新的食品類型7.發(fā)酵食品的形成過程第一階段：大分子降解階段第二階段：代謝產(chǎn)物形成階段第三階段：發(fā)酵食品的陳釀階段7.發(fā)酵的一般工藝過程（一）菌種及確定的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成根據(jù)原料特性和產(chǎn)品特征選擇適宜的微生物菌種，根據(jù)微生物菌種的特性，結(jié)合生產(chǎn)實際，制定合理的生產(chǎn)工藝流程，確定種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基（二）培養(yǎng)基制備發(fā)酵罐和輔助設(shè)備的滅菌培養(yǎng)基的分類1.按照培養(yǎng)基的純度分類：合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基2.按照培養(yǎng)基的狀態(tài)分類：固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基3.按招培養(yǎng)用途分類：斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。2.培養(yǎng)基的配制原則發(fā)酵培養(yǎng)基配制前要進行原料的預(yù)處理，掌握合適的加熱條件（加水量、氣壓、時間等），使淀粉糊化，蛋白質(zhì)達到一次變性的程度，避免未變性或過度變性（二次變性）蛋白質(zhì)出現(xiàn)。配制培養(yǎng)基需要考慮的因素有：合適的碳氮比、pH、滲透壓、生長因子和氧化還原電勢。根據(jù)具體情況，從微生物營養(yǎng)特點及生產(chǎn)工藝要求出發(fā)，選擇合適的培養(yǎng)基，已達到穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的目的，同時也要增產(chǎn)節(jié)約、因地制宜。3.培養(yǎng)基發(fā)酵罐和輔助設(shè)備的滅菌1)培養(yǎng)基滅菌配制好的培養(yǎng)基要及時采用高壓蒸汽進行加熱滅菌。發(fā)酵培養(yǎng)基實罐滅菌是先間接加熱至90℃，再間接加熱至121℃，維持30min。發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)滅菌采用的條件是130℃，維持5min。為防止“假壓”，一定要將罐內(nèi)的空氣排凈。滅菌后的實罐一般要用無菌氣體進行保壓冷卻，以防止雜菌污染。2）空罐及管道滅菌3）空氣總過濾器和分過濾器滅菌（三）菌種活化與擴大培養(yǎng)1.菌種的復(fù)壯狹義的菌種復(fù)壯：一旦發(fā)現(xiàn)菌種生產(chǎn)性狀下降或雜菌污染，就必須進行純化和優(yōu)選；廣義的菌種復(fù)壯：在菌種的生產(chǎn)的性狀尚未衰退以前，經(jīng)常有意思地進行純種分離和生產(chǎn)性狀的測定，以期使菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。2.菌種的活化和擴培沙土管孢子搖瓶液體培養(yǎng)

斜面孢子培養(yǎng)茄子瓶斜面培養(yǎng)一級種子罐培養(yǎng)冷凍干燥孢子固體培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵罐

四級種子罐培養(yǎng)

三級種子罐培養(yǎng)

二級種子罐培養(yǎng)發(fā)酵菌種的培養(yǎng)的基本類型和方法1.靜置培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)2.固體培養(yǎng)或液態(tài)培養(yǎng)3.淺層培養(yǎng)或深層培養(yǎng)4.載體培養(yǎng)法（四）發(fā)酵及過程控制采用純種混合發(fā)酵生產(chǎn)傳統(tǒng)風(fēng)味的發(fā)酵食品是方向。液體發(fā)酵是目前發(fā)酵工業(yè)上最主要的發(fā)酵形式。在食品發(fā)酵過程中，有的需要氧氣，有的需要厭氧條件。工業(yè)常用的仍是批量式發(fā)酵。（五）發(fā)酵終點判斷發(fā)酵終點的指標(biāo)有產(chǎn)物產(chǎn)量、過濾速度、氨基氮含量、菌體形態(tài)、pH、發(fā)酵液外觀和溫度等。發(fā)酵終點要綜合考慮這些參數(shù)來確定。(六）下游加工發(fā)酵技術(shù)下游加工的一般過程主要包括發(fā)酵液的預(yù)處理與分離、初步純化、高度純化、成品加工等過程。第二節(jié)菌種選育1.生產(chǎn)菌種的要求能夠用于工業(yè)生產(chǎn)的微生物菌種，要具有以下特性：1.非病原菌；2.遺傳穩(wěn)定，菌種不易變異或退化；3.易于產(chǎn)生營養(yǎng)細胞孢子或其他繁殖體，種子的生長旺盛迅速；4.必須是純種或明確的少數(shù)幾種菌組成的簡單混菌系統(tǒng)；5.對誘變劑敏感；6.能在廉價原料制成的培養(yǎng)基上生長迅速，發(fā)酵周期短，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高；7可以在易控制的培養(yǎng)條件下迅速生長繁殖。。。二、菌種選育的方法（一）選種1.樣品采集采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主。1有機質(zhì)含量和通風(fēng)情況2土壤酸堿度和植被狀況3地理條件和季節(jié)性南方土壤比北方土壤微生物多4季節(jié)分離篩選菌種2）采樣方法在選好適當(dāng)?shù)攸c后，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。2.富集培養(yǎng)在采集的樣品中，待分離的菌種不一定占優(yōu)勢，常以投其所好和取其所抗的原則在培養(yǎng)基中投放和添加特殊的養(yǎng)分或抗菌物質(zhì)，使所需菌種數(shù)量相對增加，從天然樣品中的劣勢菌轉(zhuǎn)變?yōu)槿斯きh(huán)境中的優(yōu)勢菌，從而得到富集。富集的方式包括控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、控制培養(yǎng)條件、添加特殊的抑菌劑。3.微生物的分離菌種分離的方法有兩個層次的方法：“菌落純”的水平的分離方法包括稀釋涂布和劃線分離，稀釋分離法，利用平皿中的生化反應(yīng)進行分離，組織分離法；“菌株純”水平的分離方法包括毛細管分離法，小滴分離法和顯微操作儀法。4.野生型目的菌株的篩選某些菌在目的菌株分離的基礎(chǔ)上，進一步通過篩選，選擇具有目的產(chǎn)物合成能力相對高的菌株。一般分為初篩和復(fù)篩兩步。初篩是從大量分離到的微生物將具有含成目的產(chǎn)物的微生物篩選出來的過程。初篩一般分為平板篩選和搖瓶篩兩種。復(fù)篩，一般菌株通常要重復(fù)3~5個搖瓶，培養(yǎng)后的發(fā)酵液采用精確的分析方法來測定。5.野生型目的菌株的菌株鑒定菌株鑒定一般分為3個步驟：1.獲得該微生物的純種分離物；2.測定一系列必要的鑒定指標(biāo)；3.根據(jù)權(quán)威的鑒定手冊進行菌種的鑒定。常用的鑒定指標(biāo)有形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特征、血清學(xué)反應(yīng)和遺傳特征等。（二）育種育種育種即按照發(fā)酵生產(chǎn)的要求，根據(jù)微生物遺傳變異理論，對現(xiàn)有的發(fā)酵菌種的生產(chǎn)性狀進行改造或改良，以提高產(chǎn)量改變質(zhì)量、降低成本、改革生產(chǎn)工藝。育種技術(shù)包括自然選育、誘變育種、雜交育種、原生質(zhì)體融合育種、基因工程定向育種1.自然育種自然選育：它是利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)變異，通過分離、篩選，排除劣質(zhì)性狀的菌株，選擇出維持原有生產(chǎn)水平或具有更優(yōu)良生產(chǎn)性能的高產(chǎn)菌株。（二）自然選育的目的和適應(yīng)條件目的：保持菌種優(yōu)良性狀的穩(wěn)定性；保持菌種的純度；將具有高產(chǎn)性狀的微生物從混雜的群體中分離出來，建立高產(chǎn)菌株占優(yōu)勢的群體。適應(yīng)條件：長期保存時，使菌種盡可能純化；菌種選育時，及時自然分離，得到穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株。2.誘變育種誘變育種誘變育種：是指人為地、有意識地將對象生物置于誘變劑中，使該生物體發(fā)生突變，從這些突變體中篩選具有優(yōu)良性狀的突變株的過程。突變：從生物表型上說是突然發(fā)生的可遺傳的變化，這種變化就稱為突變。帶有這種變化的菌株稱為突變菌株。突變包括基因突變（點突變或微小損傷）和染色體畸變兩大類。自然突變或自發(fā)突變：在自然狀況下發(fā)生的突變。誘發(fā)突變：在人為地用物理或化學(xué)因素誘發(fā)的突變。（二）誘變的基本原理誘變劑：用來處理微生物并能提高生物體突變頻率的物理或化學(xué)因素，稱為誘變因索，又稱誘變劑。三類：物理、化學(xué)、生物誘變劑。1.物理誘變誘變劑作用機理各不相同，誘變效果也不同?？熘凶印?0Co、γ-射線、β-射線、電離輻射，引起染色體倒位、易位、缺損、重組及其他畸變。紫外線-----不形成離子的非電離輻射(最常用)。紫外線對生物誘變最有效的波長是------200~300nm，其中260nm左右作用最大。2.化學(xué)誘變劑是一類能與DNA起作用而改變其結(jié)構(gòu)并引起DNA變異的物質(zhì)。3.生物誘變按誘變方式可分為3類：采用噬菌體，質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子分別進行轉(zhuǎn)導(dǎo)誘發(fā)突變，轉(zhuǎn)化誘發(fā)突變和轉(zhuǎn)座誘發(fā)突變，可以引起堿基的取代和斷裂，產(chǎn)生DNA的缺失，重復(fù)和插入等突變誘變育種的優(yōu)點：方法簡單，投資少，成效高等優(yōu)點缺點：缺乏定向性誘變部分應(yīng)注意出發(fā)菌株的選擇，誘變劑及劑量的選擇，誘變處理方法的應(yīng)用，篩選部分要采用有效的篩選方法來提高育種的效率。1.出發(fā)菌株的選擇和處理2.出發(fā)菌株的純化和單細胞懸液的制備3.誘發(fā)劑的使用方法4.誘變劑的劑量選擇5.突變菌株的篩選3.細胞工程育種細胞工程包括雜交育種和原生質(zhì)融合育種兩種技術(shù)。雜交育種一般是指兩個基因型不同的菌株通過吻合（結(jié)合）使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。原生質(zhì)體融合技術(shù)具有重組頻率較高，受結(jié)合型或致育性的限制較小，重組體種類較多，遺傳物質(zhì)的傳遞更為完整等多個特點。4.基因工程育種基因工程育種是指利用基因工程方法對生產(chǎn)菌株進行改造而獲得高產(chǎn)工程菌，或者是通過微生物間的轉(zhuǎn)基因而獲得新菌種的育種方法。重組DNA技術(shù)一般包括四步，即目的基因的獲得，與載體DNA分子的連接，重組DNA分子引入宿主細胞及從中篩選出含有所需重組DNA分子的宿主細胞。5.基因組改良基因組改良只需在進行首輪改組之前，通過經(jīng)典誘變技術(shù)獲得初始突變株，然后將包含若干正突變的突變株作為第一輪原生質(zhì)融合的出發(fā)菌株，此后通過遞推式的多輪融合，最終使引起正性突變的不同基因重組到同一個細胞株中。優(yōu)點：快速，高效6.代謝控制育種

快速代謝控制著育種的活力在于以誘變育種為基礎(chǔ)，獲得各種解除或繞過微生物正常代謝途徑的突變株，從而人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量生產(chǎn)積累，打破了微生物調(diào)節(jié)這一障礙。第三節(jié)發(fā)酵類型（一）固態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵是根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來定義的，一切使用不溶性固態(tài)基質(zhì)來培養(yǎng)微生物的工藝過程，都稱為固態(tài)發(fā)酵，既包括將固體懸浮在液體中的深層發(fā)酵（如固定化細胞），又包括在幾乎沒有游離可流動水的培養(yǎng)基質(zhì)上的生長及生物反應(yīng)過程。固態(tài)發(fā)酵的物料，也稱為基質(zhì)，包括各種谷物、原料、腐朽的木材、堆積的肥料或青儲飼料，甚至包括土壤。組成培養(yǎng)基的成分大多數(shù)是大分子物質(zhì)，如淀粉蛋白質(zhì)或纖維素類物質(zhì)，發(fā)酵物顆粒很小，具有很高的比表面積。2.固態(tài)發(fā)酵的特點1.相對液態(tài)發(fā)酵而言，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基水活度低，雜菌不易生存；2.基質(zhì)的混合和擴散比較困難，單位體積發(fā)酵基質(zhì)的產(chǎn)熱量較多，物料熱傳導(dǎo)系數(shù)很小，容易形成溫度、基質(zhì)濃度及產(chǎn)物濃度的梯度。3.氧氣和其他非極性氣體的溶解度和擴散性較好，霉菌的固體培養(yǎng)比液體培養(yǎng)更容易產(chǎn)生孢子。4.固態(tài)發(fā)酵多是開放式發(fā)酵系統(tǒng)，比較容易進行多菌種的混合發(fā)酵。5.有的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品，無需提取純化，直接可用于生產(chǎn)或直接使用。6.傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵方式能量消耗低，生產(chǎn)成本低，發(fā)酵副產(chǎn)品均可綜合利用。7.傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵手工操作較多，勞動強度大。3.固態(tài)發(fā)酵的應(yīng)用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)大都應(yīng)用于釀造和食品加工行業(yè)，在化工環(huán)保制藥及冶金等行業(yè)。我國的釀酒行業(yè)有兩類典型的產(chǎn)品采用了固態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)，一類是固態(tài)法制曲，一類是固態(tài)法釀酒（白酒和黃酒）。在其他食品工業(yè)中，如面包、干酪、食醋、腐乳、腌菜、發(fā)酵肉制品、食用菌等生產(chǎn)上都采用固態(tài)發(fā)酵。(二）液態(tài)發(fā)酵液態(tài)發(fā)酵是將所用原料配制成液態(tài)狀態(tài)，以液體作為物質(zhì)交換和熱量傳遞的載體。發(fā)酵分為淺盤發(fā)酵和深層發(fā)酵，目前我國和世界上多數(shù)國家的發(fā)酵工廠都采用液體深層發(fā)酵。過去多采用單罐方式分批發(fā)酵，后來又發(fā)展為連續(xù)發(fā)酵、補料分批發(fā)酵等方式。液體深層發(fā)酵的優(yōu)點1.液體懸浮狀態(tài)為很多微生物提供最適生長環(huán)境，菌體生長快，發(fā)酵產(chǎn)率高，發(fā)酵周期短；2.熱量易于擴散，便于控制，易于擴大生產(chǎn)規(guī)模；3.產(chǎn)房面積小，生產(chǎn)效率高，易進行計算機等自動化控制，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；4.產(chǎn)品易于提取，精制等。二、分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、補料分批發(fā)酵1.分批發(fā)酵分批培養(yǎng)又稱分批發(fā)酵，是指在一個密閉系統(tǒng)內(nèi)，投入有限數(shù)量的營養(yǎng)物質(zhì)后接入少量的微生物菌種進行培養(yǎng)，使微生物生長繁殖，在特定的條件下只完成一個生長周期的培養(yǎng)方法。傳統(tǒng)的生物產(chǎn)品發(fā)酵多采用此法，如啤酒發(fā)酵。分批發(fā)酵過程一般可粗分為延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。分批培養(yǎng)一級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生速度由細胞生長速率決定，一級代謝產(chǎn)物形成的比速率隨細胞比生長速率的變化而變化，最大生長速率出現(xiàn)在對數(shù)期。（二）連續(xù)發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵是指在成批發(fā)酵中，對于微生物生長受培養(yǎng)基限制的培養(yǎng)，在分批式液體深層培養(yǎng)至微生物對數(shù)生長后期時，以一定速度向發(fā)酵罐中連續(xù)添加新鮮的培養(yǎng)基，并保持對數(shù)期，細胞處于“穩(wěn)定狀態(tài)”。優(yōu)點：設(shè)備生產(chǎn)能力高，易于實現(xiàn)自動控制和勞動生產(chǎn)率高等優(yōu)點；缺點：很難保證長期的無菌操作和培養(yǎng)濃度較低。連續(xù)發(fā)酵的控制方式主要有恒化器法和恒濁器法兩類。連續(xù)發(fā)酵使用的反應(yīng)器可以是攪拌式反應(yīng)器（單罐，多罐串聯(lián)），也可以是管式反應(yīng)器（直線形，S形，蛇形等）。（三）補料分批發(fā)酵補料分批發(fā)酵又叫分批補料式培養(yǎng)，指在分批式液體深層培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期時，通過間歇或連續(xù)地向發(fā)酵罐補加滅菌的新鮮液體培養(yǎng)基，增加發(fā)酵液的總量，以維持較高的發(fā)酵產(chǎn)物的增長幅度，最后一次性收獲的培養(yǎng)方式。與分批發(fā)酵相比，補料分批發(fā)酵具有以下優(yōu)點：1.可以消除底物控制；2.可以延長次級代謝產(chǎn)物的合成時間；3.可以達到高密度細胞培養(yǎng)；4.稀釋有毒代謝產(chǎn)物，降低污染和避免遺傳不穩(wěn)定性。補料分批發(fā)酵可以分為單一補料分批發(fā)酵和反復(fù)補料分批發(fā)酵。目前分批補料式發(fā)酵在發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用廣泛，幾乎遍及整個發(fā)酵工業(yè)，包括單細胞蛋白、氨基酸、核苷酸、有機酸、有機溶劑、抗生素、維生素、生長激素和高聚物等的發(fā)酵生產(chǎn)。三、固定化酶和固定化細胞發(fā)酵固定化酶和固定化細胞發(fā)酵就是用物理或化學(xué)方法使酶成為不溶性衍生物或使細胞成為不易從載體上流失的形式，在固定化生物反應(yīng)器中催化生化反應(yīng)促進細胞增殖。這種發(fā)酵方法包括兩個過程，即酶/細胞的固定化以及它們在生物反應(yīng)器中的發(fā)酵。1.固定化酶的特點優(yōu)點：1.提純工藝簡化，產(chǎn)物質(zhì)量好。2.自動化程度高。3.穩(wěn)定性高。4.適用多酶反應(yīng)。5.批次生產(chǎn)成本降低。缺點：1.酶固定化時酶的活力有所損失，提高固定化成本2.對底物的大小和溶解度要求較高3.不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的反應(yīng)4.胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離步驟2.固定化細胞的特點優(yōu)點：1.酶活損失??；2.生產(chǎn)能力高；3.酶活穩(wěn)定；4.適合多酶連續(xù)反應(yīng)；5.產(chǎn)品質(zhì)量高。缺點：1.必須保持菌體的完整；2.必須抑制細胞內(nèi)蛋白酶的分解作用；3.必須抑制其他酶活力；4.細胞膜和細胞壁會造成底物滲透于擴散的障礙；5.載體形成空隙大小影響大分子底物的通透性等。3.酶和細胞的固定化方法常用的固定化方法可分為四種，既吸附法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法。選擇固定化方法的原則：1.必須注意維持酶的催化活性及專一性；2.固定化必須有利于生產(chǎn)自動化、連續(xù)化；3.固定化生物催化劑應(yīng)有最小的空間位阻；4.生物催化劑與載體必須結(jié)合牢固，發(fā)酵以后能回收儲藏；5.所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；6.制備方法盡可能簡單，載體來源充分，價格低廉，固定化成本要低，以利于工業(yè)使用。吸附法吸附法是利用很多酶/細胞都有吸附到固體物質(zhì)表面或其他細胞表面的能力，吸附法可分為物理吸附法和離子吸附法。物理吸附法是使用具有高度吸附能力的硅膠、活性炭、多孔玻璃、沸石、石英砂等吸附劑將酶/細胞吸附到表面上使之固定化。離子吸附法根據(jù)酶/細胞在解離狀態(tài)下可因靜電引力而固著于帶有相異電荷的離子交換劑上，常見的載體有陽離子交換劑和陰離子交換劑。共價結(jié)合法共價結(jié)合法是酶/細胞表面上官能團和載體表面的反應(yīng)基團之間形成化學(xué)共價鍵連接而實現(xiàn)固定化的方法。所用的載體可分為多糖類、乙烯聚合物、聚氨基酸和蛋白質(zhì)，無機載體。優(yōu)點：采用共價結(jié)合法固定的酶/細胞與載體的結(jié)合力較強缺點：固定過程中反應(yīng)激烈，操作較復(fù)雜，對微生物活性存在較大抑制。交聯(lián)法交聯(lián)法是用多功能試劑（而非載體）使酶與酶之間通過共價鍵交聯(lián)的固定化方法。交聯(lián)法常有四種方法：交聯(lián)試劑法，酶/細胞與輔助蛋白交聯(lián)法，吸附交聯(lián)法，載體交聯(lián)法。生產(chǎn)中，常將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，取長補短。包埋法包埋法是細胞固定化最常見的方法，即將細胞包裹于凝膠的微小格子內(nèi)或半透膜聚合物的超濾膜內(nèi)。優(yōu)點：方法成本低，操作簡單，對細胞活性的影響較小，制作的固定化細胞球的強度較高。缺點：對大分子底物很難發(fā)生催化作用。包埋使用的多孔載體主要有瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、卡拉膠、明膠、聚丙烯酰胺等等。4.固定化細胞的類型和生理狀態(tài)1.固定化細胞類型固定化細胞可分固定化微生物細胞、植物細胞和動物細胞2.固定化細胞的生理狀態(tài)：1.固定化處理細胞2.固定化靜止細胞3.固定化增殖細胞5.固定化酶/細胞的特性固定化酶的特性1.固定化酶活力的變化2.固定化酶的穩(wěn)定性3.固定化酶的米氏常數(shù)（Km)變化固定化細胞的特性1.固定化細胞的活力2.固定化細胞的最適溫度3.固定化細胞的穩(wěn)定性4.固定化細胞的最適pH5.固定化細胞的半衰期6.固定化酶和固定化細胞發(fā)酵用于固定化酶和固定化細胞發(fā)酵的反應(yīng)器的構(gòu)造和性能基本一致。比較常用的反應(yīng)器有填充床反應(yīng)器連續(xù)攪拌式反應(yīng)器流化床反應(yīng)器中空纖維反應(yīng)器和轉(zhuǎn)盤式反應(yīng)器，這些反應(yīng)器基本類型可以組合和改造使用。工業(yè)上已經(jīng)用固定化酶來生產(chǎn)果葡糖漿，L-天冬氨酸，L-蘋果酸，低乳糖奶等等。利用固定化微生物細胞可以生產(chǎn)各種胞外產(chǎn)物，如酒精和酒類、各種氨基酸、有機酸酶和輔酶、糖化酶、蛋白酶、果膠酶等等，還可以用于甾體轉(zhuǎn)化、廢水處理、有機溶劑、維生素、化工產(chǎn)品等的生產(chǎn)。四、混合培養(yǎng)物發(fā)酵混合培養(yǎng)物發(fā)酵液稱為混菌發(fā)酵，是指多種微生物混合在一起共同用一種培養(yǎng)基進行的發(fā)酵。許多傳統(tǒng)微生物工業(yè)都是混菌發(fā)酵，如酒曲的制作，白酒、葡萄酒的釀造，奶酪的制作等；許多生態(tài)制劑、發(fā)酵飼料、污水處理、沼氣池等也都是混菌發(fā)酵。第四節(jié)發(fā)酵工藝過程控制1）溫度對發(fā)酵的影響微生物發(fā)酵所用的菌體絕大多數(shù)是中溫菌，如霉菌、放線菌和一般細菌。它們的最適生長溫度一般在20～40℃。在發(fā)酵過程中，需要維持適當(dāng)?shù)臏囟?，才能使菌體生長和代謝產(chǎn)物的合成順利進行。溫度會影響各種酶反應(yīng)的速率，改變菌體代謝產(chǎn)物的合成方向，影響微生物的代謝調(diào)控機制。影響發(fā)酵液的理化性質(zhì)(對氧的溶解)，進而影響發(fā)酵的動力學(xué)特性和產(chǎn)物的生物合成。2）影響發(fā)酵溫度變化的因素產(chǎn)熱因素：生物熱（Q生物）、攪拌熱（Q攪拌）散熱因素：蒸發(fā)熱（Q蒸發(fā)）、輻射熱（Q輻射）發(fā)酵熱（Q發(fā)酵）是發(fā)酵溫度變化的主要因素,即發(fā)酵過程中釋放出來的凈熱量,以J/(m3

?h)為單位。Q發(fā)酵＝Q生物＋Q攪拌－Q蒸發(fā)－Q輻射為了使發(fā)酵能在一定溫度下進行，要設(shè)法進行控制。由于Q生物和Q蒸發(fā)，特別是Q生物在發(fā)酵過程中隨時間變化，因此發(fā)酵熱在整個發(fā)酵過程中也隨時間變化，引起發(fā)酵溫度發(fā)生波動。生物熱----微生物在生長繁殖過程中,本身產(chǎn)生的大量熱.培養(yǎng)基成分越豐富,營養(yǎng)被利用的速度越快.攪拌熱-----機械攪拌(增加溶解氧)的動能以摩擦放熱的方式,使熱量散發(fā)在發(fā)酵液中.蒸發(fā)熱----通氣時，進入發(fā)酵罐的空氣與發(fā)酵液可以進行熱交換，使溫度下降.并且空氣帶走了一部分水蒸氣,這些水蒸氣由發(fā)酵液中蒸發(fā)時，帶走發(fā)酵液中的熱量,也使溫度下降。被排出的水蒸氣和空氣夾帶著部分顯熱(Q顯)散失到罐外的熱量稱為蒸發(fā)熱.輻射熱---因發(fā)酵罐溫度與罐外溫度不同，即存在著溫差，發(fā)酵液中有部分熱量通過罐壁向外輻射，這些熱量稱為輻射熱.3）溫度控制的措施：在發(fā)酵罐中可利用夾層或盤管，用蒸汽保溫或用冷水、冷鹽水降溫，固體發(fā)酵則采用通風(fēng)、散盤、搖瓶等措施降溫；用提高室溫及堆積等辦法保濕。二、pH的影響及其控制

不同種類的微生物對pH的要求不同，微生物生長的pH也分為最低、最適、最高三種。在不同pH的發(fā)酵階段往往最適也不同。在不同pH的培養(yǎng)基中，其代謝產(chǎn)物往往也不完全相同。1)

pH值對發(fā)酵的影響

1、影響酶的活性，當(dāng)pH值抑制菌體中某些酶的活性時，會阻礙菌體的新陳代謝；2、影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細胞膜的通透性，影響微生物對營養(yǎng)物的吸收和代謝產(chǎn)物的排泄；3、影響培養(yǎng)基中某些組分的解離，進而微生物對這些成分的吸收；4、pH值不同，往往引起菌體代謝過程的不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。2)引起發(fā)酵液pH值異常波動的因素

pH值的變化決定于所用的菌種、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件。1、pH下降：（1）培養(yǎng)基中碳、氮比例不當(dāng)。碳源過多，特別是葡萄糖過量，或者中間補糖過多加上溶氧不足，致使有機酸大量積累而pH下降；（2）消泡劑加得過多；（3）生理酸性物質(zhì)的存在，銨被利用，pH下降。2、pH上升：（1）培養(yǎng)基中碳、氮比例不當(dāng)。氮源過多，氨基氮釋放，使pH上升；（2）生理堿性物質(zhì)存在；（3）中間補料氨水活尿素等堿性物質(zhì)加入過多。3)發(fā)酵pH值的確定和控制

1、發(fā)酵pH值的確定微生物發(fā)酵的最適pH值范圍一般是在5～8之間。最適pH值是根據(jù)實驗結(jié)果來確定的。同一產(chǎn)品的合適pH值，與所用的菌種、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件有關(guān)。2、pH調(diào)節(jié)和控制的方法主要有：調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的原始的pH；加入緩沖溶液（如磷酸鹽）制成緩沖能力強pH變化不大的培養(yǎng)基；選用不同代謝速度不同種類和比例的碳源和氮源；在發(fā)酵過程中加入弱酸或弱堿進行pH調(diào)節(jié)；通過調(diào)整通風(fēng)量來控制pH；補料；添加尿素等。三、溶氧的影響及其控制工業(yè)發(fā)酵發(fā)酵使用的菌種多為好氧菌，增加培養(yǎng)基中的溶解氧，可以滿足代謝的需要。在發(fā)酵過程中，影響耗氧的因素有以下幾方面：1、培養(yǎng)基的成分和菌濃2、菌齡3、發(fā)酵條件提高溶氧濃度的措施有：調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速或通氣速度來控制供氧，發(fā)酵罐中的采用空氣分布管來分散空氣，提高通氣效率；在傳統(tǒng)發(fā)酵中經(jīng)常采用打靶、翻缸、倒醅、封缸、料醅疏松或壓緊、開窗換氣等措施來提高氧的供給量。四、泡沫對發(fā)酵的影響及其控制1、泡沫的形成及其對發(fā)酵的影響在大多數(shù)微生物發(fā)酵過程中，由于培養(yǎng)基中有蛋白質(zhì)類表面活性劑存在，在通氣條件下，培養(yǎng)液中就形成了泡沫。起泡帶來的不利影響：發(fā)酵罐的裝料系數(shù)減少、氧傳遞系數(shù)減??；造成大量逃液，增加染菌機會；嚴重時通氣攪拌無法進行，菌體呼吸受到阻礙，導(dǎo)致代謝異?；蚓w自溶。泡沫的多少與攪拌、通風(fēng)、培養(yǎng)基性質(zhì)有關(guān)。蛋白質(zhì)原料如蛋白胨、玉米漿、黃豆粉、酵母粉等是主要的發(fā)泡劑。糊精含量多也引起泡沫的形成。當(dāng)發(fā)酵感染雜菌和噬菌體時，泡沫異常多。2、泡沫的消除調(diào)整培養(yǎng)基中的成分（如少加或緩加易起泡的原料）或改變某些物理化學(xué)參數(shù)（如pH值、溫度、通氣和攪拌）或者改變發(fā)酵工藝（如采用分次投料）來控制，以減少泡沫形成的機會。采用機械消泡或消泡劑來消除已形成的泡沫。采用菌種選育的方法，篩選不產(chǎn)生流態(tài)泡沫的菌種，來消除起泡的內(nèi)在因素。1）機械消泡物理消泡方法，利用機械強烈振動或壓力變化而使泡沫破裂。優(yōu)點：節(jié)省原料，減少染菌機會。缺點：消泡效果不理想，僅可作為消泡的輔助方法。罐內(nèi)消泡——靠罐內(nèi)消泡槳轉(zhuǎn)動打碎泡沫。罐外消泡——將泡沫引出罐外，通過噴嘴的加速作用或離心力來消除泡沫。2）消泡劑消泡A.消泡劑的作用：降低泡沫液膜的機械強度；降低液膜的表面黏度；以天然油脂類和聚醚類在生物發(fā)酵中最為常用。豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和豬油等。油不僅用作消泡劑，還可作為碳源和發(fā)酵控制的手段。在發(fā)酵中，要控制油的質(zhì)量、新鮮程度，并要進行發(fā)酵試驗檢驗。C.常用的化學(xué)消泡劑種類發(fā)酵工業(yè)常用的消泡劑一般可分為天然油脂類、聚醚類、醇類和硅樹脂類等四類。

天然油脂類：聚醚類消泡劑品種很多，它們是氧化丙烯或氧化丙烯和環(huán)氧乙烷與甘油聚合而成的聚合物。聚氧丙烯甘油（GP型）——氧化丙烯和甘油聚合；親水性差，在發(fā)泡介質(zhì)中的溶解度小，所以用于稀薄發(fā)酵液中要比用于粘稠發(fā)酵液中的效果好；抑泡性能比消泡性能好，適宜用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以抑制泡沫的產(chǎn)生。聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE型，泡敵）——氧化丙烯、環(huán)氧乙烷與甘油聚合；親水性好，在發(fā)泡介質(zhì)中易鋪展，消泡能力強，作用快，溶解度大，消泡活性維持時間短，用于粘稠發(fā)酵液的效果比用于稀薄的好。聚醚類消泡劑五、菌體濃度和基質(zhì)對發(fā)酵的影響及其控制(一)菌體濃度對發(fā)酵的影響及控制菌體（細胞）濃度（簡稱菌濃）是指單位體積培養(yǎng)液中菌體的含量。菌濃的大小，在一定條件下，不僅反映菌體細胞的多少，而且反映菌體細胞生理特性不完全相同的分化階段。依靠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的濃度來控制菌濃首先確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方中有個適當(dāng)?shù)呐浔?，避免產(chǎn)生過濃（或過?。┑木w量。然后通過中間補料來控制，如當(dāng)菌體生長緩慢、菌濃太稀時，則可補加一部分磷酸鹽，促進生長，提高菌濃；但補加過多，則會使菌體過分生長，超過臨界濃度，對產(chǎn)物合成產(chǎn)生抑制作用。CO2對菌體生長和產(chǎn)物形成的影響CO2影響細胞膜的結(jié)構(gòu)，細胞膜的運輸效率，細胞生長受抑制，形態(tài)發(fā)生改變。CO2濃度的大小受到菌體的呼吸強度、發(fā)酵液的流變性、通氣攪拌程度、外界壓力大小和設(shè)備規(guī)模等多種因素的影響。利用菌體代謝產(chǎn)生的CO2量來控制生產(chǎn)過程的補糖量，以控制菌體的生長和濃度。（二）基質(zhì)對發(fā)酵的影響及控制基質(zhì)即培養(yǎng)微生物的營養(yǎng)物質(zhì)碳源、氮源和磷酸鹽對發(fā)酵的影響及控制1、碳源對發(fā)酵的影響及控制

（1）迅速利用的碳源：葡萄糖、蔗糖等。迅速參與代謝、合成菌體和產(chǎn)生能量，并產(chǎn)生分解產(chǎn)物，有利于菌體生長，但有的分解代謝產(chǎn)物對產(chǎn)物的合成可能產(chǎn)生阻遏作用。（2）緩慢利用的碳源：多數(shù)為聚合物、淀粉等。為菌體緩慢利用，有利于延長代謝產(chǎn)物的合成，特別有利于延長抗生素的分泌期，也有許多微生物藥物的發(fā)酵所采用。在工業(yè)上，發(fā)酵培養(yǎng)基中常采用含迅速和緩慢利用的混合碳源。2、氮源對發(fā)酵的影響及控制

（1）迅速利用的氮源：氨基（或銨）態(tài)氮的氨基酸（或硫酸銨等）、玉米漿容易被菌體利用，促進菌體生長，但對某些代謝產(chǎn)物的合成特別是某些抗生素的合成產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，影響產(chǎn)量。（2）緩慢利用的氮源延長代謝產(chǎn)物的分泌期、提高產(chǎn)物的產(chǎn)量；但一次投入也容易促進菌體生長和養(yǎng)分過早耗盡，以致菌體過早衰老而自溶，縮短產(chǎn)物的分泌期。發(fā)酵培養(yǎng)基一般選用含有快速和慢速利用的混合氮源，還要在發(fā)酵過程中補加氮源來控制濃度。補加有機氮源，如酵母汁、玉米漿、尿素；補加無機氮源，如氨水或硫酸銨。3、磷酸鹽對發(fā)酵的影響及控制

磷是微生物菌體生長繁殖所必需的成分，也是合成代謝產(chǎn)物所必需的。微生物生長良好所允許的磷酸鹽濃度為0.32～300mmol/L，次級代謝產(chǎn)物合成良好所允許的最高平均濃度僅為1.0mmol/L.磷酸鹽濃度的控制，一般是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中采用適當(dāng)?shù)臐舛?。五、補料的控制1)補料的作用：1.及時供給菌合成產(chǎn)物的需要；2.可以解除底物抑制、產(chǎn)物反饋抑制和分解代謝物的阻遏；3.可用作控制細胞質(zhì)量的手段，以提高發(fā)芽孢子的比例；4.用于研究微生物動力學(xué)，比連續(xù)培養(yǎng)更易操作和更為精確2)補料方式及控制:1、連續(xù)流加、不連續(xù)流加、多周期流加2、快速流加、恒速流加、指數(shù)速率流加、變速流加3、單組分流加、多組分流加3)補料的判斷和依據(jù)補料時機一般以菌體形態(tài)發(fā)酵液中糖濃度、溶氧的濃度、尾氣中的氧和CO2含量、攝氧率或呼吸商的變化為依據(jù)。一般以發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛葹橹笜?biāo)，對次級代謝產(chǎn)物，還原糖濃度一般控制在5%左右的水平。也可用產(chǎn)物的形成來控制補料。第五節(jié)發(fā)酵產(chǎn)物的提取與精制一、發(fā)酵產(chǎn)物的分類1、菌體2、酶3、代謝產(chǎn)物二、發(fā)酵產(chǎn)物提取與精制的過程1、對未知的發(fā)酵產(chǎn)品提取的步驟（1）確定發(fā)酵產(chǎn)物的類型（2）確定發(fā)酵產(chǎn)物的穩(wěn)定性第二節(jié)發(fā)酵醪的預(yù)處理

一、發(fā)酵液的一般特征1、成分復(fù)雜：細胞、代謝產(chǎn)物、殘余培養(yǎng)基2、產(chǎn)品濃度低：傳統(tǒng)發(fā)酵一般1～10％3、收率低：50％左右4、失活問題5、不穩(wěn)定性6、生物安全問題7、液體黏度大，大多為非牛頓型流體二、發(fā)酵液預(yù)處理的目的和要求1、預(yù)處理的目的：（1）改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，促進懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離器的效率（2）盡可能使產(chǎn)物轉(zhuǎn)入便于后處理的某一相中（多數(shù)是液體）（3）去除發(fā)酵液中部分雜質(zhì)，以利于后續(xù)各步操作。2、發(fā)酵液預(yù)處理的內(nèi)容:（1）菌體的分離（2）固體懸浮物的去除（3）蛋白質(zhì)的去除（4）重金屬離子的去除（5）色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)等有機雜質(zhì)的去除（6）改變發(fā)酵醪的性質(zhì)（7）調(diào)節(jié)適宜pH值和溫度三、預(yù)處理的方法與步驟1.改變發(fā)酵液的過濾特性包括降低粘度、調(diào)整pH、凝集與絮凝、加入反應(yīng)劑、加入助濾劑等方法。降低液體粘度常采用加水稀釋法、升溫加熱法、降解法等措施。1、加熱法：降低懸浮液的黏度，除去某些雜蛋白，降低懸浮物的最終體積，破壞凝膠狀結(jié)構(gòu)、增加濾餅的空隙度不適用熱敏性的物質(zhì)2、調(diào)節(jié)懸浮液的pH

通過調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH到蛋白質(zhì)的等電點使蛋白質(zhì)沉淀，同時絡(luò)合重金屬離子；常用的酸化劑有草酸、鹽酸、硫酸和磷酸3、凝聚和絮凝

凝聚：在投加的化學(xué)物質(zhì)（比如水解的凝聚劑，像鋁、鐵的鹽類或石灰等）作用下，膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚成1mm大小塊狀凝聚體的過程。

凝聚劑的作用：有些是對初始粒子表面電荷的簡單中和，另一些是消除雙電荷層（采用中性鹽例如NaCl等）而脫穩(wěn)，還有些是通過氫鍵或其他復(fù)雜的形式與粒子相結(jié)合而產(chǎn)生凝聚絮凝：使用絮凝劑（通常是天然或合成的大分子量聚電解質(zhì)）將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm大小絮凝團的過程。其中絮凝劑主要起架橋作用。凝聚劑和絮凝劑的種類：（1）凝聚劑：主要是無機類電解質(zhì)，大多為陽粒子無機鹽類：硫酸鋁、明礬、硫酸鐵、硫酸亞鐵、三氯化鐵、氯化鋁、硫酸鋅、硫酸鎂、鋁酸鈉金屬氧化物類：氫氧化鋁、氫氧化鐵、氫氧化鈣、石灰聚合無機鹽類：聚合鋁、聚合鐵（2）絮凝劑（按官能團分）陰離子、陽離子、非離子丙烯酰胺經(jīng)不同的改性可成為上述三種類型之一絮凝劑比凝聚劑貴絮凝劑的最佳使用劑量：粒子表面積約有一半被聚合物覆蓋時所用的絮凝劑量。4、添加助濾劑：

一般為惰性助濾劑：是一種顆粒均勻、質(zhì)地堅硬、不可壓縮的粒狀物質(zhì)

作用：助濾劑表面具有吸附膠體的能力，并且由此助濾劑顆粒形成的濾餅具有格子型結(jié)構(gòu)，不可壓縮，濾孔不會被全部堵塞，可以保持良好的滲透性

使用方法（1）：在濾布上預(yù)涂，作為過濾介質(zhì)使用（2）：按一定比例混入待濾的懸浮液中常用的助濾劑：硅藻土、膨脹珍珠巖、石棉、纖維素、未活化的碳、爐渣、重質(zhì)碳酸鈣5、添加反應(yīng)劑：添加可溶解的鹽類，生成不溶解的沉淀；生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)；沉淀本身可作為助濾劑，還能使膠狀物和懸浮物凝固。

6、添加酶制劑：

比如：加酶將多糖轉(zhuǎn)化為單糖2.固-液分離（1）離心分離管式高速離心機、碟片式離心機（2）過濾板框過濾機、真空鼓式過濾機

過濾：分為加壓、常壓、真空過濾常用設(shè)備：板框壓濾機：分為明流式，暗流式（用于揮發(fā)性、腐蝕性、毒性物質(zhì)的過濾分離）適用于：液體產(chǎn)物澄清低濃度懸液或膠體懸液黏度高，經(jīng)加熱>100℃或>1kg壓力的懸浮液接近飽和狀態(tài)的溶液板框過濾機優(yōu)點：結(jié)構(gòu)簡單，過濾面積大（單位）成本低，動力消耗少，推動力大，耐腐蝕再生消耗不多，基本無維修，經(jīng)濟實用缺點：間歇操作，不能絕對密封勞動強度大，隨著濾餅堆厚，過濾速度下降板框過濾機型號：BAS、BMS、BMY、BAYBAY40—635/25B——板框A——暗流Y——油壓40——過濾面積m2635——框內(nèi)尺寸25——板框厚度mm板框過濾機3.、細胞破碎細胞破碎的意義微生物代謝產(chǎn)物大多數(shù)分泌到胞外，但有些目標(biāo)產(chǎn)物存在細胞內(nèi)部。目前重組DNA技術(shù)，表達的產(chǎn)品（如胰島素、干擾素、白細胞介素等），都是胞內(nèi)產(chǎn)物。首先必須將細胞破碎，使產(chǎn)物得以釋放，才能進一步提取。常用破碎方法機械法：珠磨法、高壓勻漿法、超聲波破碎法、X-press法等非機械法：酶溶法、化學(xué)滲透法、凍融法、干燥法等1、機械破碎法特點：處理量大、破碎效率高、速度快；原理：對物料的擠壓和剪切作用；主要方法：高壓勻漿珠磨超聲波破碎高壓勻漿（1）原理：細胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的間隙高速噴出后撞擊到碰撞環(huán)上，細胞在受到高速撞擊后，急速釋放到低壓環(huán)境，在撞擊力與剪切力的綜合作用下破碎。（2）影響破碎率的因素：細胞壁、壓力、溫度、通過勻漿器的次數(shù)

不適合絲狀真菌及包含體的基因工程菌

珠磨

工作原理：進入珠磨機的細胞懸浮液與極小的研磨劑，即微球（玻璃小珠、石英砂、氧化鋁d<1mm）一起快速攪拌，細胞與微球之間互相碰撞、剪切，使細胞破碎，釋放內(nèi)含物。特點：微球粒徑與目標(biāo)細胞的直徑比應(yīng)在30-100之間，適宜的微球粒徑，可以使破碎效率最高；破碎過程產(chǎn)生熱能，要注意熱交換；適用于絕大多數(shù)微生物細胞的破碎；珠磨法的破碎率一般控制在80%。

超聲波破碎1、工作原理在超聲波的作用下，液體發(fā)生空化作用，空穴的形成，增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細胞破碎2、影響因素：聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度、菌種類型3、特點：1）適應(yīng)于實驗室規(guī)模的應(yīng)用（操作簡單、液量損失少，可加冰或加冷水，大規(guī)模操作時，聲能傳遞和散熱困難）2）易失活物質(zhì)不宜用（超聲波可促使產(chǎn)生一些化學(xué)自由基因使物失活）3）G-桿菌破碎效果好，酵母菌效果差2、非機械法（1）酶溶法：（2）化學(xué)法利用化學(xué)試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分的方法①酸堿來調(diào)節(jié)溶液的pH②有機溶劑：甲苯③表面活性劑：都是兩性化合物，分子中有一個親水基團和一個疏水基團，在適當(dāng)?shù)膒H值和離子強度下，他們聚集在一起形成微膠束，使膜的通透性改變或使之溶解（3）物理法

①滲透壓沖擊法：將細胞放在高滲透壓的介質(zhì)中，達到平衡后，轉(zhuǎn)入到低滲透壓的緩沖液或純水中②凍融法：低溫冷凍而在室溫下緩慢融化③干燥法：熱空氣干燥、真空干燥、冷凍干燥二、發(fā)酵產(chǎn)物的提取提取的目的是除去與目標(biāo)產(chǎn)物理化性能有很大差異的物質(zhì)，使產(chǎn)物濃縮，并明顯提高產(chǎn)品的純度，常用的方法有沉淀法、樹脂法、吸附法、蒸餾法、萃取法、膜分離技術(shù)和凝膠層析法等等。（一）沉淀法沉淀法是最古老的分離和純化生物物質(zhì)的方法。由于其濃縮作用常大于純化作用，因而沉淀法通常作為初步分離的一種方法，用于從去除了菌體或細胞碎片的發(fā)酵液中沉淀出生物物質(zhì)，然后再利用色層分離等方法進一步提高其純度。沉淀法由于成本低、收率高(不會使蛋白質(zhì)等大分子失活)、濃縮倍數(shù)高和操作簡單等優(yōu)點，是下游加工過程中應(yīng)用廣泛的值得注意的方法。根據(jù)所加入的沉淀劑的不同，沉淀法可以分為：鹽析法；等電點沉淀法；有機溶劑沉淀法；非離子型聚合物沉淀法；聚電解質(zhì)沉淀法；高價金屬離子沉淀法。鹽析法在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱為鹽析。優(yōu)點：鹽析法成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備；操作簡單、安全；不會引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析去鹽后，能得到保持生物活性的純化蛋白質(zhì)。缺點：效果不理想，通常只是作為初步的分離純化，還需要結(jié)合其它的純化。等電點沉淀法兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時溶解度最低，不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點，以此為基礎(chǔ)進行分離的方法既等電點沉淀法。利用等電點法沉淀蛋白時必須了解制備物對酸堿的穩(wěn)定性，不然盲目使用十分危險。不少蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合后，等電點會發(fā)生偏移，故溶液中含有金屬離子時，必須注意調(diào)整pH值。等電點法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀方法聯(lián)合使用，以提高其沉淀能力。有機溶劑沉淀法利用蛋白質(zhì)在一定濃度的有機溶劑中的溶解度差異而分離的方法，稱有機溶劑沉淀法。有機溶劑能降低溶液的電解常數(shù)，從而增加蛋白質(zhì)分子上不同電荷的引力，導(dǎo)致溶解度的降低；另外，有機溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)相互聚集沉淀析出。優(yōu)點：①分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉淀；②沉淀不用脫鹽，過濾較為容易；③在生化制備中應(yīng)用比鹽析法廣泛。缺點：對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作要求在低溫下進行?？傮w來說，蛋白質(zhì)和酶的有機溶劑沉淀法不如鹽析法普遍。（二）蒸餾法蒸餾是分離液體混合物的一種有效方法，是將液-固，液-液混合物分離成較純或近于純態(tài)組分的單元操作。常用的蒸餾方法：簡單蒸餾、精餾和特殊精餾操作方式：間歇式、連續(xù)式壓力：常壓蒸餾、加壓蒸餾、真空蒸餾（三）萃取萃?。豪梦镔|(zhì)在兩種成相的溶劑中溶解度的不同，使所需的目的物質(zhì)從一種溶劑中轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中，從而達到分離純化的目的。萃取分離法的基本原理

把某組分從一個液相（水相）轉(zhuǎn)移到互不相溶的另一個液相（有機相）的過程。反萃?。河袡C相水相優(yōu)點：

1.萃取分離法設(shè)備簡單；

2.分離效果好；3.生產(chǎn)能力大，周期短，便于連續(xù)操作，容易實現(xiàn)自動化缺點：

1.費時，工作量較大；

2.萃取溶劑常是易揮發(fā)、易燃和有毒的物質(zhì)。（四）離子交換離子交換作用：是指一個溶液中的某一種離子與一個固體中的另一種具有相同電荷的離子互相調(diào)換位置，即溶液中的離子跑到固體上去，把固體上的離子替換下來。離子交換劑是一種不溶于酸堿和有機溶劑，具有一定網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固態(tài)高分子材料。優(yōu)點：化學(xué)穩(wěn)定性好，設(shè)備結(jié)構(gòu)簡單，工藝操作方便，提取效率較高，成本低和節(jié)約有機溶劑等缺點：生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生廢液多根據(jù)交換的官能團中的活性離子進行分類：陽離子交換樹脂；陰離子交換樹脂。根據(jù)樹脂在水中交換基部分發(fā)生電離時的電離程度分為強酸性、弱酸性陽離子交換樹脂和強堿性、弱堿性陰離子交換樹脂四大類及吸附、螯合、兩性和氧化還原樹脂等。三、發(fā)酵產(chǎn)物的精制經(jīng)過初步純化后，濾液的體積已大大縮小，但純度提高不多，需要進一步精制。精制的方法很多，常見的有色層分離，電泳和結(jié)晶等。（一）結(jié)晶結(jié)晶過程具有高度選擇性，只有同類分子或離子才能結(jié)合成晶體。發(fā)酵工業(yè)中常見的結(jié)晶方法有等電點結(jié)晶、添加有機溶劑結(jié)晶、部分溶劑蒸發(fā)結(jié)晶、熱飽和溶液冷卻、添加晶種結(jié)晶和鹽析結(jié)晶等。（二）電泳電泳法是靠溶質(zhì)在電場中移動速度不同而分離的方法。溶質(zhì)必須帶電，可以本身是離子或由于吸附離子而帶電。應(yīng)用最普遍的是凝膠電泳法。（三）層析分離

層析分離法又稱色層分離法、色譜法：即是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的形狀和大小、分子的極性、吸附力、分子的親和力、分子的分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同程度分布在兩相中，其中一相是固定的，稱固定相；另一相是流動的，稱流動相。當(dāng)流動相流過固定相時，各組分以不同的速度移動，而達到分離。特點：分離效率高，應(yīng)用范圍廣，選擇性強，高靈敏度的在線檢測，快速分離，過程自動化操作。課后作業(yè)請從腐乳、醬油、食醋三種發(fā)酵食品中任選一種，寫出其制作工藝流程及每個工藝流程中發(fā)生的物理化學(xué)變化（重點）和感官品質(zhì)變化，尤其是有關(guān)發(fā)酵的部分要詳寫。（必須手寫）發(fā)酵食品的常用菌種以及其在發(fā)酵中的應(yīng)用。染菌對發(fā)酵的影響1發(fā)酵異?，F(xiàn)象及染菌原因分析2雜菌污染的途徑和防治3第六節(jié)污染防治與挽救1、什么叫發(fā)酵染菌?

在發(fā)酵過程中，生產(chǎn)菌以外的其他微生物侵入了發(fā)酵液，從而使發(fā)酵過程失去了真正意義上的純種培養(yǎng)。

菌種培養(yǎng)過程操作不當(dāng)培養(yǎng)基滅菌不徹底發(fā)酵設(shè)備（如發(fā)酵罐、管道）密封不嚴空氣除菌不凈2、造成發(fā)酵染菌的可能途徑有哪些？

染菌仍是發(fā)酵工業(yè)的致命傷。輕者影響產(chǎn)率、產(chǎn)物提取收得率和產(chǎn)品質(zhì)量；嚴重者造成生產(chǎn)失敗，浪費大量原材料，造成嚴重經(jīng)濟損失，而且擾亂生產(chǎn)秩序，破壞生產(chǎn)計劃。遇到連續(xù)染菌，特別是又找不到染菌原因，未有防治措施時，往往會影響人們的情緒和生產(chǎn)積極性，造成無法估量的危害。3、染菌會對發(fā)酵工業(yè)造成哪些不良影響？污染雜菌的不同種類1不同階段染菌2不同染菌的原因3不同染菌程度4染菌對發(fā)酵的影響不同雜菌的種類對發(fā)酵的影響

在抗生素的發(fā)酵過程中，青霉素的發(fā)酵污染細短產(chǎn)氣桿菌比粗大桿菌的危害更大;鏈霉素的發(fā)酵污染細短桿菌、假單孢桿菌和產(chǎn)氣桿菌比污染粗大桿菌更有危害；谷氨酸的發(fā)酵最怕噬菌體的污染。發(fā)酵過程危害最大的雜菌種類

青霉素的發(fā)酵鏈霉素的發(fā)酵四環(huán)素的發(fā)酵谷氨酸的發(fā)酵檸檬酸的發(fā)酵細短產(chǎn)氣桿菌細短桿菌、假單孢桿菌雙球菌、芽孢桿菌、莢膜桿菌噬菌體青霉菌不同雜菌的種類對發(fā)酵的影響

回對整個發(fā)酵過程的危害極大。嚴重干擾生產(chǎn)菌的生長繁殖。干擾生產(chǎn)菌的代謝，影響產(chǎn)物的生成。影響相對較小。不同生產(chǎn)階段染菌對發(fā)酵的影響種子培養(yǎng)期染菌發(fā)酵后期染菌發(fā)酵前期染菌發(fā)酵中期染菌回將導(dǎo)致染菌范圍不斷擴大，使生產(chǎn)蒙受重大損失。使發(fā)酵大面積染菌。一般不具延續(xù)性，使單個（批）發(fā)酵罐發(fā)酵失敗。染菌幾率較大。不同染菌原因?qū)Πl(fā)酵的影響種子帶菌設(shè)備滲漏空氣帶菌培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底回

染菌程度越嚴重，即在發(fā)酵罐內(nèi)的雜菌數(shù)量就多，對發(fā)酵的危害也就越大。但當(dāng)生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程已有大量的繁殖，并已在發(fā)酵液中占優(yōu)勢，如果污染極少量的雜菌，此時對發(fā)酵不會帶來太大的影響。不同染菌程度對發(fā)酵的影響回2.發(fā)酵異?，F(xiàn)象及染菌原因分析溶解氧和CO2的異常變化1PH過高或過低2泡沫異常3代謝異常4溶解氧的異常變化

當(dāng)雜菌是好氣性微生物時，溶解氧的變化是在較短時間內(nèi)下降，直至接近于零，且在長時間內(nèi)不能回升；

當(dāng)雜菌是非好氣性微生物，而生產(chǎn)菌由于受污染而抑制生長，使耗氧量減少，溶解氧升高。回

好氣性發(fā)酵排出的氣體中的CO2含量與糖代謝有關(guān)。對于特定的發(fā)酵過程，工藝確定后，排出的氣體中的CO2

含量的變化是有規(guī)律的。染菌后，培養(yǎng)基中糖的消耗發(fā)生變化，引起排氣中CO2含量的異常變化，如雜菌污染時，糖耗加快，CO2含量含量增加，噬菌體污染后，糖耗減慢，CO2含量減少。因此，可根據(jù)CO2含量的異常變化判斷染菌。排氣的CO2異常變化

還可以根據(jù)其他的一些異?，F(xiàn)象，如菌體生長不良、PH值的異常變化、發(fā)酵過程中泡沫的異常增多、發(fā)酵液的顏色異常變化、代謝產(chǎn)物含量的異常下跌、發(fā)酵周期的異常拖長、發(fā)酵液的粘度異常增加等判斷染菌。其它異常現(xiàn)象回染菌的檢查和判斷

發(fā)酵過程是否染菌應(yīng)以無菌試驗的結(jié)果為依據(jù)進行判斷。在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，如何及早發(fā)現(xiàn)雜菌的污染并及時采取措施加以處理，是避免染菌造成嚴重經(jīng)濟損失的重要手段。因此，生產(chǎn)上要求能準(zhǔn)確、快速的檢查出雜菌的污染。目前常用于檢查是