第四章 細胞破碎和分離技術

第四章細胞破碎和分離提

取技術發(fā)酵液或培養(yǎng)液預處理固液分離（離心或過濾）固體沉淀：胞內產物清液：胞外產物目標產物目標產物細胞破碎和細胞碎片分離本章內容一、細胞破碎的主要阻力：細胞壁細胞破碎的主要目的：破壞細胞壁和細胞膜，使細胞內物質釋放出來。各種微生物細胞壁組成與結構二、常用細胞破碎技術及原理（一）機械法（二）物理法（三）化學法（四）生物法（五）超臨界細胞破碎技術（一）機械法利用高壓、研磨或超聲波等手段使細胞受到擠壓，剪切和撞擊作用1、珠磨法2、高壓勻漿法3、超聲破碎法1、珠磨法珠磨法原理：細胞懸浮液與極細的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑與細胞之間的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內含物。注意：破碎時要采取冷卻措施2、高壓勻漿法利用高壓迫使懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖撞造成細胞破裂高壓勻漿機進料口出料口注意：團狀或絲狀真菌不適用3、超聲破碎法原理：空化作用和攪拌作用缺點：產生的熱量不容易驅散，不適于大規(guī)模操作，主要用于實驗室。。不同機械破碎方法的比較（二）物理法1、滲透壓沖擊法2、冷凍-融化法1、滲透壓沖擊法（最溫和）將細胞放在高滲溶液中（如高濃度蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細胞內水分便向外滲出，細胞發(fā)生收縮，當達到平衡后，將細胞轉入水或低滲緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內，引起細胞快速膨脹而破裂。洋蔥質壁分離僅適用于細胞壁較脆弱的細胞。2、冷凍-融化法（2）原理：一方面破壞細胞膜的通透性，另一方面胞內水結晶，形成冰晶粒，細胞液濃度增高引起細胞溶脹而破裂。（1）方法：將細胞放在低溫下冷凍，然后在室溫中融化，反復多次而達到破壁作用。適用于細胞壁較脆弱的菌體，需反復多次，速率慢，產量低，在凍融過程中可能引起某些蛋白質變性。大腸桿菌：可用液氮/37℃反復凍融法破壁（三）化學法（化學滲透法）1、堿處理2、酸處理3、化學試劑法1、堿處理pH值=11.5---12.5堿處理可導致細胞溶解。優(yōu)點：價格便宜，適于任何規(guī)模的操作，易使蛋白使活。2、酸熱法鹽酸對細胞壁中的某些成分（主要是多糖和蛋白質）的水解作用，使細胞壁結構變疏松，同時經沸水浴處理，細胞吸水膨脹破裂。缺點：破壁效果差，后續(xù)處理難除HCl。3、化學試劑法（1）EDTA螯合法：導致外層膜不穩(wěn)定或溶解革蘭氏陽性菌革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌的外層膜結構通?？慷r陽離子Ca2+或Mg2+結合脂多糖和蛋白質來維持，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內層膜的磷脂來填補，從而導致內層膜通透性的增強。（2）有機溶劑法有機溶劑能溶解細胞壁的脂類，從而改變細胞通透性。能溶解膜結構中的脂蛋白，使細胞通透性增加。（3）表面活性物質化學法的優(yōu)缺點優(yōu)點①通用性差；②時間長，效率低，一般胞內物質釋放率不超過80％。③有些化學試劑有毒，后續(xù)工作需設法分離除去。缺點細胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。（四）生物法1、酶溶法（2）常用的酶：溶菌酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、蛋白酶等。（1）原理：利用酶溶解細胞壁，使細胞壁受到部分或完全破壞；其中溶菌酶主要用于細菌類，其他酶對酵母作用較顯著。溶菌酶：能直接水解G+菌細胞壁，作用位點是肽聚糖多肽鏈中的β-1，4糖甘鍵。G+菌的細胞壁G-菌的細胞壁2、自溶法通過調節(jié)溫度、pH等誘導細胞產生溶解自身的酶。酵母自溶45-50℃12-24h（五）超臨界細胞破碎技術1、超臨界流體（1）臨界溫度：在溫度高于某一數值時，任何大的壓力均不能使該物質由氣相轉化為液相，此時的溫度即被稱之為臨界溫度；（2）臨界壓力：臨界溫度下，氣體能被液化的最低壓力稱為臨界壓力。（3）超臨界流體：指溫度和壓力處于臨界條件之上的流體。CO2的臨界值：31.26℃；7.38MPa2、超臨界CO2的破壁原理超臨界CO2密度近于液體，粘度近于氣體，擴散系數為液體的100倍，因而具有驚人的溶解能力。超臨界CO2易于滲透到細胞內，突然降壓后，因細胞內外較大的壓差而使細胞急劇膨脹而破裂。超臨界細胞破碎技術適用于各類細胞的破碎1、細胞的處理量2、細胞壁的強度和結構3、目標產物對破碎條件的敏感性4、破碎程度三、選擇破碎方法的依據適宜的操作條件應有高的產物釋放率，低的能耗和便于后步提取這三方面進行權衡1、簡要說明常用的細胞破碎方法、原理及特點？作業(yè)與思考題細胞碎片去除和產品純化同步的方法四、從發(fā)酵液直接分離產物細胞破碎目標產物細胞碎片很小，很難用過濾法除去。（一）雙水相分離技術1、雙水相體系簡介明膠瓊脂（或可溶性淀粉）1896年，荷蘭微生物學家Beijerinck發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的雙水相體系是指高聚物雙水相體系憎水程度有所差異（1）聚乙二醇(PEG)/葡聚糖；（2）聚乙二醇(PEG)/鹽相（硫酸鹽或者磷酸鹽）2、常用雙水相體系聚乙二醇(PEG)無毒、無刺激性，具有良好的水溶性3、雙水相體系分離細胞碎片目標產物細胞或細胞碎片優(yōu)點：設備簡單，容易放大缺點：規(guī)模放大時，成本增加

用PEG1500/NaH2PO4體系從Trichodermakoningii發(fā)酵液中分離純化β-木糖苷酶，該酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，純化倍數33。（二）膨脹床分離技術1、膨脹床的定義（1）固定床：又稱填充床，填充的固體物通常呈顆粒狀，堆積成一定高度的床層。床層靜止不動，流體通過床層進行分離純化。（2）流化床：當流體通過床層的速度逐漸提高到某值時，填料顆粒出現(xiàn)松動，顆粒間空隙增大，床層體積出現(xiàn)膨脹，但是顆粒仍逗留在床層內而不被流體帶出。床層的這種狀態(tài)和液體相似稱為流化床（3）膨脹床穩(wěn)定的、返混很小的流化床，即所謂的膨脹床,它既能比較容易地讓細胞或細胞碎片通過填料層，又能以填充床的模式來吸附目標產物。（4）膨脹床與固定床的區(qū)別膨脹床的床層上部安裝有可調節(jié)床層高度的調節(jié)器，當料液從床底輸入時，床層產生膨脹，高度調節(jié)器上升，床層空隙增加，允許菌體細胞或細胞碎片自由通過。因此，膨脹床吸附操作可直接處理菌體發(fā)酵液或細胞勻漿液，回收其中的目標產物。膨脹床吸附技術節(jié)省離心或過濾等處理過程（5）膨脹床與流化床的區(qū)別流化床的填料和液體在床層內混合程度高，吸附效率低，而膨脹床的填充顆?；緫腋∮诠潭ǖ奈恢?，液體的流動與固定床相似，接近平推流，吸附效率高。2、膨脹床裝置色譜柱調節(jié)柱床高度保證液體以平推流形式流過柱子3、膨脹床吸附劑（1）吸附劑應具備的條件①吸附性能好②沉降速率高③吸附劑要在粒徑和密度上有差異④有良好孔道結構，不易被污染（2）常用吸附劑多糖包埋石英砂，玻璃微球等。如Streamline介質：在石英砂外表面包裹了一層瓊脂糖物理吸附，化學吸附和離子交換吸附瓊脂糖上的功能基團可以被修飾，提高目標產物的吸附容量4、膨脹床的操作（5個步驟）（1）平衡：用平衡緩沖液讓膨脹床達到平衡，保持一定的膨脹率。膨脹2倍，吸附性能最好通過流速控制膨脹率（2）進料吸附把目標產物吸附在吸附劑上，讓雜質或細胞碎片等固體顆粒流出膨脹床。（3）洗滌洗去留在柱內的細胞、細胞碎片和弱吸附性的雜質。洗滌結束后，改用固定床操作（4）洗脫采用固定床操作，將配制好的洗脫液用橫流泵從柱上部導入，下部流出，分段收集，并分析檢測目標產物的活性峰位置。（5）柱床的再生和清洗原因：非特異性吸附污染試劑：0.5-1mol/L的NaOH（常用）方法：控制流速，使柱床膨脹5倍，清洗3小時4、膨脹床的操作（5個步驟）（1）平衡（2）進料吸附（3）洗滌（4）洗脫（5）柱床再生和清洗5、膨脹床的應用納豆激酶的分離提取納豆：大豆經納豆菌發(fā)酵而成降血壓，抗癌抗氧化，溶血栓納豆激酶1980年，日本心腦血管專家須見洋行博士，從事溶解血栓藥物研究工作“下午兩點半”實驗下午兩點半：納豆提取物加入到人工血栓中；下午五點半：血栓溶解2厘米1、泡豆蒸豆大豆，加水浸泡一夜后，蒸爛。

2、接種納豆菌

納豆菌用熱水溶解后，加入到大豆中，攪拌均勻，分裝。

3、在恒溫下發(fā)酵14-36小時

4、后熟（活菌低溫休眠）

發(fā)酵后，放在冰箱內低溫熟成數小時，做好的納豆無論是外觀還是口感都會更好。納豆的制作（三）泡載分離技術1、定義又稱泡沫分離或泡沫吸附分離，是以氣泡為介質，利用組分的表面活性差異進行分離的技術。空氣2、原理通過向溶液鼓泡形成泡沫層，表面活性物質會聚集在泡沫層內，然后將泡沫層與液相主體分離。活性劑補充口泡沫液體破沫器泡沫液氣體（1）表面活性物質的分離純化（2）能與表面活性物質結合的任何物質如金屬離子如蛋白質，廢水中的去污劑等3、應用如：環(huán)境領域

從工業(yè)污水如電鍍廢水、紡織廢水中分離和回收金屬離子。回