第二三章 紫外可見吸收光譜法

第二章紫外-可見吸收光譜法2.1信號和信息的特征2.2紫外-可見吸收光譜法定量分析基礎(chǔ)2.3紫外可見分光光度計的基本組成與結(jié)構(gòu)2.4紫外可見分光光度法的基本實驗技術(shù)2.5紫外可見光譜法的應(yīng)用光譜分析概述光學(xué)分析方法：待測物受到某種能量作用后，產(chǎn)生光等信號或引起光信號變化的分析方法光譜類型：分子光譜、原子光譜光與物質(zhì)相互作用的方式反射，漫反射反射光譜法吸收與透射吸收光譜法發(fā)射發(fā)射（熒光）光譜法散射散射光譜法折射衍射與干涉偏振與旋光光的波粒二象性

1.光的波動性電場磁場xyz傳播方向Diagramwastakenfrom:DouglasA.SkoogandJamesJ.Leary,PrinciplesofInstrumentalAnalysis,4thed.,SaundersCollegePublishing,1992,page61.光波的描述ln波長(m、mm，nm)頻率(Hz)；c光速(=3.0*1010cm/sec)

0246810-1.0-0.50.00.51.0lOnecyclenl=c

光的粒子性E=hv;E(eV)=1240/l(nm)=h（普朗克常數(shù)）=6.63x10J/s頻率-34n=-

波數(shù)wavenumber(cm-1)nln1/Planck方程：統(tǒng)一:

P=h/l電磁波譜g-射線X-射線可見紅外微波射頻2004008003200(nm)波長真空紫外可見與紅外核磁共振波長減小，能量增加紫外

光譜的基本類型物質(zhì)的顏色:物質(zhì)對不同波長的光具有選擇性的吸收作用而產(chǎn)生的。物質(zhì)呈現(xiàn)的顏色和吸收的光顏色之間是互補(bǔ)關(guān)系。分子的內(nèi)部運(yùn)動原子內(nèi)部粒子的運(yùn)動：Eatom

=Enuclear+E電子繞核+E電子自旋

對氫原子來說，電子繞核運(yùn)動的能量為：En=-13.6/n2(eV)UV-VISE電子自旋ESRE核自旋NMR分子內(nèi)部的粒子運(yùn)動Em=E0+Ek+Ee+Ev+ErEm分子能E0零點能Ek

平動能Ee

價鍵電子能（1~20eV)：UV-VISEv

原子振動能(0.05~1eV):IREr

分子轉(zhuǎn)動能(<0.05eV):FIR電子躍遷基態(tài)E0激發(fā)態(tài)E1DE=E1-E0=hn能級輻射e能級差DE光與物質(zhì)的相互作用E=Em-En=hv躍遷定則*光的顏色與物質(zhì)的顏色（溫度顏色）；*輻射、吸收與躍遷（光強(qiáng)幾率，波長能級）；

5BasicHues:red(R),yellow(Y),green(G),blue(B)andpurple(P).粒子結(jié)構(gòu)與光譜特征粒子特征粒子能級光譜特征運(yùn)動狀態(tài)變化輻射層次光譜研究2.1信號和信息的特征2.1.3分子外層價鍵電子的軌道與能級2.1.2紫外可見光譜的信息2.1.3信息負(fù)載的宏觀過程

特點紫外-可見(ultraviolet-visible簡稱UV-VIS)吸收光譜分析:利用分子內(nèi)電子,躍遷產(chǎn)生紫外-可見吸收光譜來進(jìn)行定性定量分析。原子的d,f軌道電子2.1.3分子外層價鍵電子的

軌道與能級原子軌道:S,P,D,F分子軌道:s,p,n,p*,s*分子軌道具有不同的能級，這些能級的允許躍遷產(chǎn)生分子吸收光譜。

STRUCTUREANDENERGYNon-bondingOrbitalsOrbitalp*OrbitalpOrbitals*OrbitalUnoccupiedlevelOccupiedlevelEnergylevel2.1信號和信息的特征2.1.1分子外層價鍵電子的軌道與能級2.1.2紫外可見光譜的信息2.1.3信息負(fù)載的宏觀過程

1.產(chǎn)生UV-VIS吸收的幾種躍遷s

s*:CC,CH;pp*:C=C,C=O,CC;（K帶）n

s*:O,N,P,鹵素;np*:同時有n,p軌道;（R帶）共軛PP*:具有共軛P鍵；電荷遷移:d,f電子躍遷：過渡金屬元素分子軌道能級與躍遷nm10020030040050060070080001234lgess*ns*np*pp*共軛PP*>C=O,>C=S,>C=N,N=N,-N=O,-NO2C-S,O-C,N-C2.簡單分子的紫外-可見吸收法

分子躍遷lmax(nm)R-OHR-O-RR-NH2R-SHR2C=CR2R-C=C-RR-C-NR-N=N-Rs*ns*ns*ns*np*pp*ps*ns*n180180190210175170160340分子Transitionlmax(nm)R-NO2R-CHOR2CORCOOHRCOORRCONH2p*np*pp*np*pp*np*np*np*n271190290180280205205210簡單分子的紫外-可見吸收.E帶E帶R帶含氮化合物3.共軛分子一般地說，每增加一個共軛雙鍵，則吸收波長增加約30nm。EFFECTOFCONJUGATIONDiagramwastakenfrom:DonaldL.Paviaet.al.,IntroductiontoSpectroscopy,SaundersGoldenSunburstSeries,1979,page192An=3Bn=4Cn=5200300380Wavelength,nmLogeUVSpectrumofDimethylpolyenesCH3(CH=CH)nCH3(1)共軛二烯鏈?zhǔn)?17nm同環(huán)214nm異環(huán)253nm(2)a,b-不飽和酮鏈?zhǔn)?15nm五元環(huán)202nm六元環(huán)215nm4.苯及衍生物E帶:180~184nm(e=47000)K帶:200~204nm(e=7000)B帶:230~270nm(e=200)SPECTRUMOFANTHRACENEWavelength(nm)AbsorbanceC14H105.大分子

b-胡蘿卜素的吸收光譜β－胡蘿卜素DOESITABSORBINTHEUV/VISREGION?CH3CH3CH3OHVitaminA1葉綠素的吸收光譜葉綠素的分子能級按光譜分析理論可以理解：該系統(tǒng)可以最充分與有效地利用太陽能。結(jié)論

植物色素系統(tǒng)是若干億年生物進(jìn)化的結(jié)果，按光譜分析理論可以理解：該系統(tǒng)可以最充分與有效地利用太陽能。分子結(jié)構(gòu)吸收光譜生物功能2.2.1比爾定律吸光度A=lgI/I0=lg=e

Cl1T其中T:透過率Transmittancee:摩爾吸收系數(shù)Molarextinctioncoefficientl:光程PathlengthC:濃度Concentratione單位：1/(mol*cm)2.2紫外-可見吸收光譜法定量分析基礎(chǔ)2.2.2比爾定律與光譜的表達(dá)2.2.3比爾定律圖解2.2.4比爾定律的局限性物質(zhì)只能吸收特定頻率的光（單色光）；無限稀溶液（各物質(zhì)的吸收獨立）；物質(zhì)間無相互作用（物質(zhì)之間，物質(zhì)與樣品間）。實際因素非單色光（<1/5光譜帶寬）非平行光光的散射（或漏光、高級衍射光）高濃度（>0.01M）化學(xué)作用（pH,電離，締合等）熒光折光系數(shù)的改變儀器噪聲EFFECTOFSTRAYLIGHT1.02.002.55.07.510.0Concentration,M*103Absorbance0.0%0.2%1.0%5.0%Straylight=*100IsIoDiagramwastakenfrom:DouglasA.SkoogandJamesJ.Leary,PrinciplesofInstrumentalAnalysis,4thed.,SaundersCollegePublishing,1992,page131.EFFECTOFpHVALUEDiagramtakenfrom:JamesD.IngleJr.andStanleyR.Crouch,SpectrochemicalAnalysis,prentice-HallInternationalEditions,page3741.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10325400475550625700(nm)Absorbance10986.869876.86.56AbsorptionSpectrumofPhenolredatVariouspHvalues第三章紫外-可見吸收光譜法3.1信號和信息的特征3.2紫外可見分光光度計的基本組成與結(jié)構(gòu)3.3紫外可見分光光度法的基本實驗技術(shù)3.4紫外可見光譜法的應(yīng)用3.2紫外-可見分光光度計的基本組成與結(jié)構(gòu)3.2.1基本組成

光源單色器樣品室檢測器顯示器鎢燈氘燈濾光片棱鏡光柵光電池光電管光電倍增管V0I0VI當(dāng)切斷光線時，調(diào)0HW紅藍(lán)S2紫外-可見與紅外分光光度計的設(shè)計單色器的結(jié)構(gòu)Δλ單色器的性能棱鏡分辨率：R=b(dn/dλ)光柵分辨率：R=mN單色器帶寬：Δλ=S(dl/dλ)-1=S(dδ/dλ)-1/f2.3.2整機(jī)的光路結(jié)構(gòu)1.單光束紫外-可見分光光度計的光路結(jié)構(gòu)2.雙光束分光光度計3.雙光束雙波長分光光度計λ1λ2光源單色器I1I2R=V1/V2=I1/I2斬光器PMT參比波長測得信號為：R=V1/V2=I1/I2光源單色器遮光板參比池樣品池斬光器PMT雙光束雙波長分光光度計光路圖4.其它類型(二極管陣列)PumpingSystem

-ImprovedSealLongevity-2.4基本實驗技術(shù)2.4.1分光光度計的選用與性能調(diào)試2.4.2分光光度計的校正2.4.3分析條件的設(shè)定2.4.4定量分析的方法2.4.5定量分析結(jié)果的評價2.4.6提高定量分析準(zhǔn)確度的方法分析的準(zhǔn)確度性能主要因素調(diào)試方法影響光學(xué)波長范圍光學(xué)器件檢查特征波長的能量適應(yīng)性波長精確度光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)波長由大至小和由小至大分別檢查同一波長的重復(fù)性分析的精確度波長準(zhǔn)確度光學(xué)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)用已知波長的單色光來校正（如氘燈656.1nm，486.0nm,汞燈，苯峰247.1,252.9,258.9nm等）性能主要因素調(diào)試方法影響系統(tǒng)作用光能量見公式3.11測定儀器能量輸出檢出限單色光帶寬狹縫和線色散用原子，分子光譜譜線（如氘燈，汞燈）來檢查準(zhǔn)確度雜散光強(qiáng)度光學(xué)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，器件表面缺陷和散射標(biāo)準(zhǔn)物NaBr測定檢出限性能主要因素調(diào)試方法影響光度計整機(jī)光度計準(zhǔn)確度器件非線形光學(xué)器件檢查標(biāo)準(zhǔn)物的吸收準(zhǔn)確度信噪比器件與環(huán)境噪聲波長、狹縫、增益等參數(shù)不變測定信號變化的幅度精確度準(zhǔn)確度分析速度器件響應(yīng)速度、系統(tǒng)結(jié)構(gòu)見手冊精確度準(zhǔn)確度2.4.2分光光度計的校正2.4.2分光光度計的校正表觀光譜與真實光譜單光束：相對強(qiáng)度雙光束：絕對強(qiáng)度2.4.3分析條件的設(shè)定1.分析波長的選擇原則:一般選擇最大吸收波長。特殊情況:a.有干擾時(干擾成份或干擾峰)；b.溶劑影響;c.帶寬不滿足要求時.2.儀器帶寬的選擇帶寬對分析的影響整機(jī)帶寬<(1/5~1/10)光譜帶寬3.吸光度范圍的選擇吸光度范圍：0.2~0.8abs特殊情況：吸光度太?。杭哟蠊獬涛舛忍螅簻p少光程，稀釋原液4.參比的選擇理論上，參比應(yīng)該是樣品中除分析成分外的所有物質(zhì)；實際中，用什么做溶劑就用它作參比。*比如，水溶液或乙醇溶液、丙酮溶液。*溶劑的選擇：截至波長,極性小*溶劑極性對最大吸收波長的影響。SOLVENTCUT-OFFSAcetonitrileChloroformCyclohexane1,4-Dioxane95%Ethanol190nm240195215205n-HexaneMethanolIsooctaneWaterTrimethylphosphate201nm205195190210溶劑極性的影響非極性溶劑極性溶劑nnp*ppp*n-p*p-p*p-p*n-p*能量溶劑極性溶劑極性增加，p-p*躍遷紅移n-p*躍遷藍(lán)移2.4.4定量分析的方法公式法:比爾定律，e值已知，l準(zhǔn)確。工作曲線法：克服隨機(jī)誤差，l準(zhǔn)確度的影響減小。標(biāo)準(zhǔn)加入法2.4.5定量分析結(jié)果的評價靈敏度，檢測限，精確度，準(zhǔn)確度，線形范圍，回收率靈敏度與e值的關(guān)系:1.e>10E(4),高靈敏度；2.e=10E(3~4)，中等靈敏度；3.e<10E(3),低靈敏度。

2.4.6提高定量分析準(zhǔn)確度的方法(折射示差法）1.高吸收法:當(dāng)吸光度>0.8abs時;050%100%050%100%C1T1TrTP真實表觀C2.低吸收法:當(dāng)吸光度<0.2abs時050%100%050%100%CTrTP真實表觀T2C23.最精確法:當(dāng)吸光度相近時。050%100%050%100%C1T1TrTP真實表觀T2CC2局限性表面上看，折射示差法的應(yīng)用是不受限制的，實際并不如此，隨著放大倍數(shù)a的增加，必須加大狹縫和提高檢測器的靈敏度，導(dǎo)致噪聲升高，且偏離線形。2.雙波長法和多組分測定ab比爾定律滿足線性加和性；用于懸濁液。3.導(dǎo)數(shù)光譜法作用：扣除慢變化背景和散射背景，提高分辨率導(dǎo)數(shù)光譜消除寬背景吸收干擾分辨兩個紫外光譜相近組份2.5紫外可見光譜法的應(yīng)用2.5.1定性分析：確定官能團(tuán)異構(gòu)，雙鍵共軛情況等。(1)如200~400nm無吸收,則無共軛。(2)如230~270nm有吸收，e=100~1000，則有芳香化合物。(3)如270~350nm有吸收，e=10~100，且200~270nm無峰，則為n--p*;若200~270nm有峰，則可能是a、b--不飽和酮。(4)如200~400nm，則可能是長共軛體系或稠環(huán)、雜環(huán)化合物。

2.5.2定量分析定量分析的基礎(chǔ)是比爾定律。葉綠素含量測定；氨基酸含量測定：水合茚三酮580nm(藍(lán)紫）蛋白質(zhì)含量測定：利用苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸的芳香環(huán)吸收直接測定。染色法：coomassieblueDOESITABSORBINTHEUV/VISREGION?HNCH2CHNH2COOHTryptophanMOLECULARSTRUCTUREOF

COOMASSIEBRILLIANTBLUESPECTRUMOFCOOMASSIE

BRILLIANTBLUE2.5.3其它應(yīng)用1.DNA純度分析：A280：A260：A230=0.515:1:0.45核酸及蛋白質(zhì)的重要波長：230nm:核酸光譜最小吸收，蛋白質(zhì)肽鍵;260nm:核酸280nm:蛋白質(zhì)的芳香氨基酸及肽；320nm:蛋白、核酸均無吸收。ACTG脫氧核苷三磷酸鹽（dNTP）GACT純蛋白質(zhì)（雜質(zhì)）282nm混合物259nm雙鏈DNAPCR引物及其對應(yīng)單鏈的熔點測定熔化過程曲線及導(dǎo)數(shù)光譜熔化過程曲線