酶工程第10章固定化酶催化的動力學特征

第十章固定化酶催化的動力學特征一、酶的固定化對其動力學特性的影響二、影響固定化酶動力學的因素三、外擴散限制效應四、內擴散限制效應一、酶的固定化對其動力學特性的影響1．酶活性的變化酶在固定化時，總會有一部分未被固定而殘留在溶液中，造成了酶的部分損失；同時由于各種原因也會造成已被固定的酶的活性有所下降。這是大多數(shù)固定化酶的情況，只有個別的酶在固定化后活性未變或反而升高。如果固定化酶的動力學仍服從米氏方程，則可通過米氏常數(shù)Km值的大小來反映酶在固定化前后活性的變化。一些酶在溶液中和固定化后的米氏常數(shù)值

酶底物固定化試劑Km（mol/L）

肌酸激酶ATP無（溶液酶）對氨苯基纖維素6.5×10－48.0×10－4

乳酸脫氫酶NADH無（溶液酶）丙酰玻璃7.8×10－65.5×10－5

α－糜蛋白酶N-乙酰酪氨酸乙酯無（溶液酶）可溶性醛葡聚糖

1.0×10－31.3×10－3

無花果蛋白酶N-苯酰精氨酸乙酯無（溶液酶）CM-纖維-702×10－22×10－2

胰蛋白酶苯酰精氨酰胺無（溶液酶）馬來酸/1,2-亞乙基

6.8×10－32.0×10－4

酶活性變化的評價指標酶活性表現(xiàn)率：

指實際測定的固定化酶的總活性與被固定化了的酶在溶液狀態(tài)時的總活性之比。酶活性收率：指實際測定的固定化酶的總活性與固定化時所用的全部游離酶的活性之比。

上述兩種評價指標的差別在于是否考慮了剩余的未被固定化的酶。2．酶穩(wěn)定性的變化一般來說，酶被固定化后，無論是保存時的穩(wěn)定性，還是使用時的穩(wěn)定性均有提高。據(jù)理論推測，酶固定化后其半壽期將增加1倍。同時，固定化酶的熱穩(wěn)定性也有所提高，要比溶液酶提高10多倍。這是因為固定化后，酶的空間結構變得更為堅固，加熱時不易變性，增加了酶的熱穩(wěn)定性。

二、影響固定化酶動力學的因素1．空間效應：（1）構象效應

酶的活性部位和變構部位的性質取決于酶分子的三維空間結構。酶在固定化過程中，由于存在著酶和載體的相互作用，從而引起了酶的活性部位發(fā)生某種扭曲變形，改變了酶活性部位的三維結構，減弱了酶與底物的結合能力，此種現(xiàn)象稱為構象效應。影響固定化酶動力學的因素1．空間效應：（2）屏蔽效應載體的存在又可產(chǎn)生屏蔽效應，或稱為位阻效應。因為載體的存在使酶分子的活性基團不易與底物接觸，從而對酶的活性部位造成了空間障礙，使酶活性下降。影響固定化酶動力學的因素2．分配效應當固定化酶處在反應體系的主體溶液中時，反應體系成為固液非均相體系。人們常把固定化酶顆粒附近的環(huán)境稱為微環(huán)境，而把主體溶液體系稱為宏觀環(huán)境。由于固定化酶的親水性、疏水性及靜電作用等引起固定化酶載體內部底物或產(chǎn)物濃度與溶液主體中濃度不同的現(xiàn)象稱為分配效應。分配效應中的分配系數(shù)

這種分配效應一般采用液固界面內外側的底物濃度之比，即分配系數(shù)來定量表示。設界面內側的底物濃度為[S]i，界面外側的底物濃度為[S]o，則分配系數(shù)K可表示為：靜電作用造成的分配效應

通常酶可能被固定在帶電荷的酶膜上或載體上。底物在溶液中也會離子化，這樣在固定的電荷和移動的離子之間，常會發(fā)生靜電相互作用，產(chǎn)生分配效應。根據(jù)Boltzman分配定律，分配系數(shù)K可以表示為式中

Z—底物分子所帶的電荷；F—法拉第常數(shù)；U—載體的靜電電勢；R—氣體常數(shù)；T—絕對溫度。

當載體與底物所帶的電荷相反時，K大于1；當兩者帶有相同電荷時，K小于1。

考慮靜電作用的反應速度方程對于固定化酶催化的反應，其底物濃度應取在固定化酶內外表面附近的微環(huán)境的數(shù)值。因為，當Z和U異號時，K>1，，反應速度增高；反之，，反應速度降低；當任何一方電荷為零時，不變。影響固定化酶動力學的因素3．擴散效應固定化酶催化反應時，底物必須從主體溶液進入到固定化酶內部的活性中心處，反應的產(chǎn)物又必須從固定化酶的活性中心傳出到主體溶液中。這種物質的傳遞過程主要是擴散過程，擴散的速率在某些情況下會對酶反應速度產(chǎn)生限制作用，特別是當擴散速率緩慢而酶的催化活性又很高時，這種限制作用會相當明顯。

外擴散和內擴散

外擴散是指底物從主體溶液向固定化酶的外表面的擴散，或產(chǎn)物從固定化酶的外表面向主體溶液中的擴散。外擴散發(fā)生在酶反應之前或之后。由于外擴散阻力的存在，使底物或產(chǎn)物在主體溶液和固定化酶外表面之間產(chǎn)生濃度梯度。

內擴散是對有微孔的載體而言。底物從固定化酶的外表面擴散到微孔內部的酶活性中心處，或是產(chǎn)物沿著相反途徑的擴散。對底物而言，內擴散限制與酶催化反應同時進行。固定化酶底物和產(chǎn)物的分布狀況酶的本征動力學空間效應難以定量描述，并且它與固定化方法、載體的結構及性質、底物分子的大小和形狀等因素有關?？臻g效應的影響一般是通過校正動力學參數(shù)Vm和Km來體現(xiàn)的。在此基礎上建立起來的動力學方程一般稱之為本征動力學（intrinsicdynamics），所測得的反應速度稱為本征反應速度。

本征動力學是指酶的真實動力學行為，包括溶液酶和固定化酶。對于后者，它僅將空間效應的影響考慮在內。從這個意義上講，固定化酶的本征動力學與溶液酶的本征動力學是有差別的。固有動力學分配效應造成的結果是使微觀環(huán)境與宏觀環(huán)境的底物濃度出現(xiàn)差別，從而影響酶催化反應的速度。如果在上述本征動力學的基礎上，加上這種分配效應造成的濃度差異對動力學產(chǎn)生的影響，所建立的動力學稱為固有動力學（inherentdynamics）。對這種動力學比較簡單的處理方法是：動力學方程仍然服從米氏方程的形式，僅對動力學參數(shù)予以修正。有效動力學不論分配效應是否存在，固定化酶受到擴散限制時所觀察到的反應速度稱為有效反應速度，此時的動力學稱為有效動力學（effectivedynamics），或稱宏觀動力學。由于生化物質在溶液內和固定化酶微孔內的擴散速率是比較慢的，所以擴散阻力是影響固定化酶催化活性的主要因素，并且建立起來的有效動力學方程也不完全服從米氏方程。

幾種動力學之間的關系固定化酶反應動力學的特征

對固定化酶反應動力學，不僅要考慮固定化酶本身的活性變化，還要考慮到底物等物質的傳質速率的影響，而傳質速率又與底物等物質的性質和載體的性質，以及操作條件等因素有關。因此對于這樣一個為非均相體系建立起來的動力學方程，不僅包括酶的催化反應速度，而且還包括了傳質速率。這是固定化酶催化反應過程動力學最主要的特征。三、外擴散限制效應為了集中研究外擴散限制效應，常選用液體不能滲透的無電活性的固定化酶膜或固定化酶顆粒作為研究的模型。在這種情況下，固定化酶催化反應的過程包括3步：①底物從主體溶液擴散到固定化酶的外表面；②底物在固定化酶的外表面上進行反應；③產(chǎn)物從固定化酶的外表面擴散進入主體溶液。其中，①和③為單純的傳質過程，②為催化反應過程。其中任一步速率發(fā)生變化，都會影響到整個酶反應速度。

外擴散限制效應假定一不帶電荷的固定化酶，其外表面上的反應速度符合米氏方程形式，即

式中：Vi為底物在固定化酶外表面上的消耗速度，又稱宏觀反應速度，單位為mol/(L·s)；

[S]i為底物在固定化酶外表面上的濃度，單位為mol/L。外擴散限制效應

底物由主體溶液擴散到固定化酶外表面的速率應表示為

式中：Vd為底物由主體溶液擴散到固定化酶外表面的速率，單位為mol/(L·s)；

kL

為液膜的傳質系數(shù)，“m/s”；

a

為單位體積所具有的傳質表面積，“m-1”；

kLa為體積傳質系數(shù)，“s-1”；[S]0為底物在主體溶液中的濃度，“mol/L”

外擴散限制效應在穩(wěn)態(tài)條件下，應有

，即

該式表示在穩(wěn)態(tài)條件下，外擴散傳質速率等于在固定化酶外表面上底物的反應速度。

外擴散限制效應

當外擴散傳質速率很快，而固定化酶外表面的反應速度相對較慢，成為該反應過程速度的限制步驟時，固定化酶外表面的底物濃度應為主體溶液中的底物濃度，即。這時的反應速度應為在這種情況下，酶反應速度不受傳質速率的影響，為該酶的本征反應速度，或稱在此條件下可能達到的最大反應速度，用表示。

外擴散限制效應

當外擴散傳質速率很慢，而酶表面上的反應速度很快，此時傳質速率成為限制步驟。固定化酶外表面上的底物濃度趨于零，有

在這種情況下，酶反應速度與最大傳質速率相等，用表示。

外擴散限制效應上述兩種情況為兩種極端的情況，一般的情況處于這兩者之間，稱為過渡區(qū)，如圖所示。在過渡區(qū)的酶反應速度為宏觀反應速度，它可由兩種方法求得。（1）由[S]i值確定Vi值在過渡區(qū)，[S]i值應滿足方程

外擴散限制效應由可得

兩邊同除以[S]0，并給方程左邊的分子分母同除以[S]0得

外擴散限制效應引入，，并定義，

式中：為無因次底物濃度；為無因次米氏常數(shù)；為無因次準數(shù)，常稱為Damk?hler

（丹克萊爾）準數(shù)。

外擴散限制效應將上式整理成一元二次方程標準形式

令，代入上式得

解此方程可得

根據(jù)題意，只能為正值，故

外擴散限制效應解出后，根據(jù)求出，再將

代入即可求出

在上述方法中，是一個重要的無因次準數(shù)，其物理意義為

外擴散限制效應在上述方法中，是一個重要的無因次準數(shù)，其物理意義為

當<<1時，酶催化的最大反應速度要大大慢于底物的傳質速率，此時該反應過程由反應動力學控制；當>>1時，底物的傳質速率大大慢于酶催化的最大反應速度，此時該反應過程由傳質擴散控制。

外擴散限制效應（2）作圖法求[S]i值和Vi值根據(jù)，底物在固定化酶外表面的濃度應同時滿足傳質速率方程式和反應速度方程式，因此也可通過作圖法求出值和相應的值。

外擴散限制效應四、內擴散限制效應

對于固定于多孔性載體中的固定化酶，其催化反應的主要部位是在顆粒內部。內擴散阻力主要來自于微孔內的阻力。這種內擴散阻力的大小與固定化酶顆粒內部的物理結構參數(shù)、反應物的性質等因素有關。在討論內擴散對固定化酶催化反應動力學的影響時，常將均勻分布著酶的多孔球形顆粒作為研究的模型。因此要首先研究顆粒載體的結構參數(shù)和物質在微孔內的擴散。1．載體的結構參數(shù)a．比表面積Sg它指單位質量載體所具有的內表面積，以m2/g表示。通過實驗測定，一般載體的比表面積可達200～300m2/g。b．微孔半徑多孔載體的內表面積與微孔孔徑的大小有關?？讖皆叫。缺砻娣e越大。若單位質量載體所具有的孔體積以Vg表示，則平均微孔半徑為

微孔半徑的計算設微孔為圓柱狀管道，長為l，半徑為r

，則其內表面積（不算兩端）孔體積

兩式相除，

載體的結構參數(shù)c．孔隙率載體的孔隙率為載體顆粒內孔隙所占有的體積與該顆粒體積之比。因此值恒小于1，它在數(shù)值上與Vg的關系為

。式中為表觀密度，它表示單位顆粒體積中所含有的固體的質量。

載體的結構參數(shù)d．顆粒當量直徑為了表示不同形狀固定化酶顆粒的大小，一般采用如下方法：①以與顆粒體積相等的球體直徑dV表示，稱為“體積相當直徑”；②以與顆粒外表面積相等的球體直徑dS

表示，稱為“外表面積相當直徑”；③以與顆粒的比表面積相等的球體直徑dSV表示，稱為“比表面積相當直徑”。體積相當直徑對于同一非球形顆粒，按上述不同定義表示的當量直徑在數(shù)值上是不同的。假設某任一形狀的固定化酶顆粒，其體積為VP，外表面積為AP，則根據(jù)上述定義的各當量直徑分別為：體積相當直徑dV外表面積相當直徑外表面積相當直徑dS

比表面積相當直徑

比表面積相當直徑dSV形狀系數(shù)ψ描述顆粒形狀可引入形狀系數(shù)的概念，用ψ表示。其定義為與顆粒體積相同的球體的外表面積AS與顆粒的外表面積AP之比，即ψ＝。由于體積相同的幾何體中球體的外表面積最小，所以一般是AS<AP，ψ<1。如果顆粒就是球體，則ψ＝1。ψ表示了任意顆粒的外形與球體相接近的程度，故又稱為圓球度。正方體顆粒的圓球度為0.806。

載體的結構參數(shù)e．顆粒密度顆粒密度有3種定義方法：顆粒表觀密度固體的質量/顆粒的體積顆粒真密度固體的質量/固體的體積顆粒堆密度固體的質量/床層的體積上述3種密度的差別在于體積計算的不同，顯然存在。

2．物質在微孔內的擴散分子在微孔內的擴散分為兩種機理：①一種稱為分子擴散，此種擴散的阻力來自于分子之間的碰撞，擴散速率主要受分子之間相互碰撞的影響，而與微孔直徑的大小無關。②另一種稱為努森（Knudson）擴散，其擴散的阻力主要來自于分子與孔壁之間的碰撞，而分子之間的碰撞影響較小。它常發(fā)生在微孔直徑較小的情況下。分子擴散與努森擴散

微孔內某一組分進行的擴散屬于哪一種擴散機理，與分子運動的平均自由程及微孔直徑的

d

相對大小有關。當≤0.01時（也就是平均自由程相對短且微孔直徑相對大時），為分子擴散；當≥10時（也就是平均自由程相對長且微孔直徑相對小時），為努森擴散。介于這兩者之間則屬于兩種擴散機理并存。微孔內液體分子的擴散速率在液體中，由于液體中的分子的平均自由程很小，所以液體在微孔內的擴散機理一般視為分子擴散。其擴散速率由分子擴散系數(shù)決定，而液體的分子擴散系數(shù)比氣體的分子擴散系數(shù)小得多。微孔內液體分子的擴散速率可用Fick定律來表達：式中：Ns為底物S的擴散通量；x為沿擴散方向的距離；De為底物S在微孔內的有效擴散系數(shù)。

分子擴散系數(shù)與有效擴散系數(shù)

有些固定化酶顆粒，其顆粒內部的微孔是彎彎曲曲的，而不是整齊的圓柱體，微孔的大小也不均勻，微孔之間可能封閉，也可能相通。因此與在主體溶液中進行的分子擴散相比，擴散阻力明顯增大，其有效擴散系數(shù)要比分子擴散系數(shù)小。

曲節(jié)因子當固定化酶顆粒內部的微孔是任意取向，顆粒的孔隙率為時，對顆粒單位外表面積而言，微孔的開口面積所占的分數(shù)也為。各微孔可能相互交叉，各微孔的形狀和同一微孔不同部位的截面積也存在差異，這使得分子在顆粒內的擴散與在一圓柱形的微孔內的擴散顯然是不同的，常引入一個校正參數(shù)對此進行校正，稱為曲節(jié)因子，或稱為彎曲系數(shù)、溝路曲折系數(shù)等。位阻因子有時底物或產(chǎn)物可能是大分子，此時微孔壁會對這些大分子產(chǎn)生一定的阻礙作用，此作用常以位阻因子H表示?？紤]到上述因素，有效擴散系數(shù)De與分子擴散系數(shù)D的關系為式中：為固定化酶顆粒的孔隙率，其值為0～1；為曲節(jié)因子，其值一般為1.4～7；H——位阻因子，其值為0～1。

大分子的受阻擴散

當微孔直徑比擴散分子直徑大得多時，位阻因子H近似為1。但在某些情況下，例如蛋白質分子的擴散，其直徑與微孔直徑幾乎為同一數(shù)量級，此時，位阻因子H就變得很重要，這時的擴散又常稱為受阻擴散。在微孔內進行擴散時，有效擴散系數(shù)比在主體溶液中擴散明顯減小，對于常用固定化凝膠，大約為0.5～0.8。某些底物在生物凝膠中的有效擴散系數(shù)（水溶液）凝膠種類膠濃度（質量%）底物溫度（℃）有效擴散系數(shù)（m2/s）海藻酸鈣2葡萄糖256.1×10－10海藻酸鈣2乙醇251.0×10－9海藻酸鈣2色氨酸306.67×10－10明膠3.8蔗糖52.09×10－10明膠5.7蔗糖51.86×10－10明膠7.6蔗糖51.35×10－10明膠25乳糖50.37×10－103．微孔內反應組分的濃度分布在微孔內擴散和反應同時進行，因而沿著從外到里的方向，底物濃度和反應速度同時在下降。要描述濃度及反應速度的變化規(guī)律，必須首先建立包括擴散和反應在內的質量衡算方程式。由于內擴散狀況與固定化酶顆粒的形狀有關，并且固定化酶顆粒多為球形，下面就以球形固定化酶顆粒為討論對象。

（1）質量衡算方程