華西廖林川老師課件 檢材及檢材處理2

9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年第二章檢材及檢材處理〔續(xù)〕廖林川教授四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年可供選用的方法9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年1．預(yù)處理

預(yù)處理是前處理的第一步，包括檢材制備、調(diào)整酸堿度、去除蛋白及結(jié)合物的水解等。

9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年〔1〕檢材制備均勻分散的狀態(tài)才能適用例如：大塊的、不均勻的體外檢材血液、尤其是組織檢材9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年〔2〕調(diào)整酸、堿度理論酸性物質(zhì)，抑制解離最適宜的pH值是低于該毒物的pKa值1～2；堿性毒物，那么宜高于該毒物的pKa值1～2；具酸、堿兩性的毒物也可尋找一最正確pH條件，抑制其解離。在調(diào)節(jié)酸堿度時(shí)，還應(yīng)考慮到毒物本身的穩(wěn)定性等具體情況。例如，某些具有酯、酰胺、亞酰胺、甙鍵等結(jié)構(gòu)的化合物，在酸性或堿性條件下有可能分解，必要時(shí)需采用緩沖液來(lái)保持酸堿度。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年〔3〕去除蛋白質(zhì)

有些檢材富含蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)要干擾檢測(cè)，蛋白質(zhì)方法很多，各種方法有各自特點(diǎn)及適用范圍。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年

沉淀蛋白質(zhì)方法方法試劑主要適合分離的毒物①加入與水混溶的有機(jī)溶劑無(wú)水乙醇、甲醇、乙腈、丙酮等酸性、中性及堿性毒物②加入無(wú)機(jī)鹽類常用硫酸銨堿性毒物及其代謝物③加入酸性沉淀劑三氯醋酸、高氯酸、鎢酸、苦味酸酸性、中性毒物④加入重金屬鹽類汞鹽、銅鹽、鋅鹽等酸性、中性及堿性毒物9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年〔4〕結(jié)合物的解離

與蛋白質(zhì)或葡萄糖醛酸、硫酸等形成結(jié)合物，需要通過(guò)水解的方式使結(jié)合狀態(tài)的毒物釋放出來(lái)以利于提取

常用的方法有酸水解法和酶水解法。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年酸水解法

如對(duì)嗎啡、吩噻嗪類、巴比妥類等都能顯著提高回收率，但對(duì)不耐熱或遇酸易水解的物質(zhì)如烏頭堿、阿托品、可卡因、撲熱息痛、安定、利眠寧等不適用。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年酶水解法在一定pH值及常溫條件下，酶能使生物檢材如組織、血液中呈結(jié)合狀態(tài)的毒物釋放出來(lái)。酶消化法的優(yōu)點(diǎn)是消化作用溫和，凈化程度好，防止了某些毒物的分解。缺點(diǎn)是消化時(shí)間較長(zhǎng)，試劑不易保存。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年2．液‐液提取法

物質(zhì)在不同溶劑中有不同的溶解度。當(dāng)兩種互相不混溶的溶劑共存時(shí)，溶質(zhì)在這兩種溶劑中分配的溶解量不同。利用這一性質(zhì)將溶質(zhì)從一種溶劑中轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中的過(guò)程稱為液‐液萃取。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年

該法適用于液態(tài)檢材，如血、尿等可根據(jù)其中所含待檢物種類的不同采取不同的提取方式。液‐液萃取的裝置可根據(jù)檢材量的大小，采用常量萃取裝置〔如分液漏斗〕，或微量萃取裝置。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年

萃取可以將所需組分從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑中去，也可使之從有機(jī)溶劑轉(zhuǎn)移到水溶液中，后者常稱作反萃取或反提。萃取或反萃取的效率主要取決于分配比。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年分配比與萃取效率當(dāng)溶質(zhì)在互不相溶的兩種溶劑中溶解分配到達(dá)平衡時(shí)，兩相中該溶質(zhì)的濃度比分配比〔distributioncoefficient〕，以D表示如下9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年CO

為有機(jī)相中該溶質(zhì)的濃度

CA為水相中該溶質(zhì)的濃度

W0為兩相中溶質(zhì)的總量

W1為一次萃取后水相中的溶質(zhì)留存量

VO為有機(jī)溶劑的體積

VA為水的體積

9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年分配比因不同的溶質(zhì)和溶劑系統(tǒng)而異。溫度。溶質(zhì)存在狀態(tài)。低濃度時(shí)，溶質(zhì)狀態(tài)的變化較小，濃度影響不大，可以將分配比看作是在一定溫度范圍內(nèi)的一個(gè)常數(shù)。

假設(shè)以W1表示一次萃取后水相中留存溶質(zhì)的量9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年在實(shí)際中，由于溶劑不可能完全不混溶，被萃取液體積及其濃度也可能改變，故萃取效率不可能與以上計(jì)算完全一致，但如果測(cè)得分配比后，可據(jù)此估算，以比較萃取方法的優(yōu)劣。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年萃取方法液‐液萃取應(yīng)制備適當(dāng)?shù)乃嗖⑦x擇適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年有機(jī)溶劑一些難溶于有機(jī)溶劑的，如季銨鹽等，不宜用液‐液萃取，可改用液‐固萃取。因水相中常含多種其他組分，選用溶劑時(shí)還應(yīng)考慮到能使那些不需要的組分不進(jìn)入或少進(jìn)入有機(jī)相。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年有機(jī)溶劑一般常用的有機(jī)溶劑有：乙醚、氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷、苯、醋酸乙酯等等。混合萃取溶劑。沸點(diǎn)較高的溶劑，不易揮凈，可能會(huì)使熱穩(wěn)定性差的毒物受損失，故不宜用作萃取溶劑。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年萃取方式萃取可采用一次、屢次或連續(xù)萃取等方式。乳化問(wèn)題可通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間靜置、鹽析、加破乳劑或高速離心等方法解決。連續(xù)萃取是一種反復(fù)循環(huán)萃取的方式，其優(yōu)點(diǎn)是防止屢次萃取的繁瑣操作、減少有機(jī)溶劑的用量、防止乳化發(fā)生等；但費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，不宜使用混合溶劑，也不宜用于反萃取。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年注意①防止毒性②減少乳化③脫水劑脫水④防止反響〔如氯仿與胺類毒物〕⑤防止毒物損失及燃燒事故9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年改進(jìn)Stas‐Otto法當(dāng)分析目標(biāo)不夠明確，或疑有多種理化性質(zhì)不同的毒物存在時(shí)可采用改進(jìn)Stas‐Otto法9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年液‐固提取法

〔liquid-solidextraction〕

應(yīng)用廣泛的檢材前處理方法，根據(jù)固定相填料的種類不同可分為正相固相萃取、反相固相萃取、離子交換固相萃取等。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年正相固相萃取填料多為硅膠，鍵合有極性基團(tuán)，如丙氰基、二醇基、丙氨基等。柱上的保存行為取決于極性化合物分子結(jié)構(gòu)中的極性基團(tuán)與硅膠鍵合相上的極性基團(tuán)之間的相互作用。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年反相固相萃取

固定相的極性小于洗脫液的極性，即采用非極性的固定相和中等極性或極性洗脫液。填料也多為硅膠鍵合相，但其鍵合的官能團(tuán)為非極性，如十八烷基、辛烷、苯基、二甲基丁烷、甲基、乙基、丁基等。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年離子交換固相萃取別離帶有電荷的毒物，根據(jù)填料及用途不同又分為陽(yáng)離子和陰離子交換柱。陽(yáng)離子交換柱的填料通常為含有脂肪族磺酸基的鍵合硅膠，在一定的pH條件下帶有負(fù)電荷，能夠吸附帶正電荷的化合物。。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年離子交換固相萃取陰離子交換柱的填料通常是將脂肪族季銨鹽鍵合在硅膠上。季銨鹽堿性很強(qiáng)，帶有正電荷，能夠?qū)ж?fù)電荷的化合物保存在柱上而與雜質(zhì)別離開(kāi)。

選擇適宜的pH條件是實(shí)現(xiàn)高效萃取的關(guān)鍵。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年

除了上述三種類型的固相萃取柱外，還有的固相萃取是利用吸附作用或分子篩作用實(shí)現(xiàn)待檢物的別離。這類固相柱的填料包括無(wú)鍵合硅膠、三氧化二鋁、硅膠鎂、石墨、大孔樹(shù)脂等，適用于極性和非極性毒物的萃取。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年固相柱根本構(gòu)造圖9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年三種洗脫方式9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年可通過(guò)減壓抽吸或加壓方式提高效率可以防止液‐液萃取所帶來(lái)的許多麻煩，比方乳化、低回收率及廢液等。而且操作簡(jiǎn)單，處理樣品快。要根據(jù)別離對(duì)象的不同通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選適宜的固定相材料、洗脫條件〔包括洗脫所用溶劑、洗脫時(shí)間等〕。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年

固相微萃取

〔solidphasemicroextraction，SPME〕萃取頭伸入檢樣中或置于樣品上部空間，保存一定時(shí)間，待檢物吸附于其上后取出纖維頭。在進(jìn)行氣相色譜〔gaschromatography，GC〕或高效液相色譜〔highperformanceliquidchromat-ography，HPLC〕分析時(shí)，將纖維頭直接插入儀器，利用熱解吸附或流動(dòng)相將待檢毒物洗脫下來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年簡(jiǎn)單方便，快速，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣為一體。但該法的缺點(diǎn)是纖維頭的壽命不長(zhǎng)圖2-12SPME器械圖左：SPME手柄中：SPME萃取頭右：SPME的總裝置圖9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年

圖2‐9SPME‐GC及SPME‐HPLC分析示意圖收回萃取頭插入檢樣瓶收回萃取頭伸出萃取頭吸附待測(cè)物插入GC進(jìn)樣口熱解吸樣品插入LC進(jìn)樣口流動(dòng)相解吸收回萃取頭進(jìn)入柱子流動(dòng)相9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年三、其他前處理技術(shù)實(shí)現(xiàn)提取、別離目的或提高檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度及擴(kuò)大檢測(cè)對(duì)象范圍，比方化學(xué)衍生化、柱切換等技術(shù)。這些技術(shù)還能簡(jiǎn)化繁瑣的操作過(guò)程，尤其是柱切換技術(shù)使在線凈化富集待檢物能簡(jiǎn)便、快速地實(shí)現(xiàn)。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年化學(xué)衍生化在一定條件下，利用某些特殊的試劑與毒物反響，使生成的衍生化產(chǎn)物更有利于在色譜儀上進(jìn)行別離和檢測(cè)。擴(kuò)大了色譜法的應(yīng)用范圍，使得一些難于直接用氣相色譜法或液相色譜法檢測(cè)的毒物也能夠被檢測(cè)出來(lái)。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年

在氣相色譜法中，目的在于：①增加待檢物的揮發(fā)性，擴(kuò)大分析范圍；②增加待檢物的熱穩(wěn)定性；③改善待檢物的色譜行為，即制成衍生物后容易與其他組分或雜質(zhì)分開(kāi)；④增加某些檢測(cè)器對(duì)待檢物的靈敏度和選擇性。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年

高效液相色譜法對(duì)于待檢物的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性要求不高，所以較少采用衍生化技術(shù)。但是在有些情況下，為了使待檢物在檢測(cè)器上有更高的響應(yīng)值以及改善色譜行為。9月1日2006年四川大學(xué)華西根底醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院9月1日2006年