微生物酶資源的開(kāi)發(fā)利用

微生物酶資源的開(kāi)發(fā)利用第一頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日Contents酶的簡(jiǎn)介酶制劑的工業(yè)應(yīng)用微生物酶的開(kāi)發(fā)酶的改造第二頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日一、酶的簡(jiǎn)介酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的一種生物催化劑。在酶的參與下，生物體內(nèi)的新陳代謝才能有序進(jìn)行。酶商品化生產(chǎn)在1897年后，最初開(kāi)始由動(dòng)植物提取；之后由霉菌開(kāi)始生產(chǎn)淀粉酶；二次世界大戰(zhàn)后，用微生物獲得商品化酶制劑形成規(guī)模性的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。20世紀(jì)90年代后，基因工程＋發(fā)酵工藝＋先進(jìn)發(fā)酵設(shè)備是酶工業(yè)的第三個(gè)飛躍。這個(gè)飛躍使微生物酶制劑地位進(jìn)一步加強(qiáng)。第三頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日二、微生物酶的工業(yè)應(yīng)用用微生物生產(chǎn)的商業(yè)化酶已有百余種。但產(chǎn)量大、應(yīng)用廣、經(jīng)濟(jì)效益高的酶品種主要是各種分解酶。另外，基因工程改造酶也從根本上改變了人們的生活。

1.食品加工業(yè)

2.環(huán)境保護(hù)

3.生物化工

4.醫(yī)療衛(wèi)生

5.紡織業(yè)第四頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日淀粉酶淀粉酶是能催化淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖的一類(lèi)酶的總稱。淀粉酶作用于淀粉、糖原和多糖衍生物。α-淀粉酶：從底物分子內(nèi)部將糖苷鍵裂開(kāi)；β-淀粉酶：從底物的非還原性末端將麥芽糖單位水解下來(lái)；葡萄糖淀粉酶：從底物的非還原性末端將葡萄糖單位水解下來(lái)。第五頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日蛋白酶水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類(lèi)酶的總稱。按其水解多肽的方式，可以將其分為內(nèi)肽酶和外肽酶兩類(lèi)。蛋白酶已廣泛應(yīng)用在皮革、毛皮、絲綢、醫(yī)藥、食品、洗滌等方面。第六頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日纖維素酶改善飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提高飼料的利用率防止環(huán)境污染纖維素酶是一種重要的酶產(chǎn)品，是一種復(fù)合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等組成，將纖維素分解成寡糖或單糖。在飼料、酒精、紡織和食品等領(lǐng)域具有巨大的市場(chǎng)潛力，將是繼糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工業(yè)酶種。第七頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日脂肪酶自然界中有許多微生物可以通過(guò)它們分泌的脂肪酶來(lái)利用油脂作為生長(zhǎng)所需的碳源物質(zhì)。由于微生物脂肪酶的種類(lèi)很多，具有比動(dòng)植物更廣泛的pH適應(yīng)性、溫度范圍及對(duì)底物的專(zhuān)一性，又便于生產(chǎn)，更容易獲得高純度制劑，因此其在研究和應(yīng)用上的進(jìn)展相當(dāng)迅速。用途：藥物作用，幫助消化，降低血脂及治療局部炎癥等；生物能源；皮革造紙等。第八頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日青霉素?；赣捎谌祟?lèi)對(duì)抗生素的無(wú)節(jié)制的濫用，因細(xì)菌產(chǎn)生的抗藥性已使天然青霉素的治療效果明顯下降。為了解決細(xì)菌的抗藥性問(wèn)題，人們利用青霉素?；傅淖饔脕?lái)改變天然青霉素的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，使其具有抵御抗藥性微生物β-內(nèi)酰胺酶攻擊的能力。該酶廣泛存在于細(xì)菌、放線菌、霉菌及酵母菌內(nèi)。用途：用于新青霉素的半合成；催化水解和合成除頭孢霉素之外的頭孢霉素衍生物。第九頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日*********青霉素?；概c抗生素改造NN青霉素6-APAR=第十頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日工業(yè)規(guī)模的酶催化轉(zhuǎn)化葡萄糖異構(gòu)酶高果糖玉米糖漿，固定床反應(yīng)器，多家公司，年產(chǎn)量>1,000,000t乳糖酶無(wú)乳糖牛奶，固定床反應(yīng)器，多家公司，年產(chǎn)量超過(guò)100,000t腈水解酶丙烯酰胺，分批反應(yīng)器，NittoCo，年產(chǎn)量>10,000t脂肪酶類(lèi)可可脂，固定床反應(yīng)器，F(xiàn)ujiOil青霉素酰化酶氨芐青霉素，攪拌式固定床反應(yīng)器，DSM第十一頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日高選擇性底物專(zhuān)一性化學(xué)、區(qū)域、對(duì)映體選擇性酶催化雜合性生物催化劑能作用反應(yīng)日益增多DielsAlderase，1995年Claisen重排，分支酸變位酶，1989年反應(yīng)條件溫和常溫、常壓、中性pH及水相中高溫淀粉酶（啤酒發(fā)酵）高催化活性1234優(yōu)點(diǎn)FeCl3反應(yīng)速率1,0002H2O22H2O+O2血紅素1,000,000過(guò)氧化氫酶1,000,000,000酶催化的優(yōu)點(diǎn)第十二頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日三、微生物酶的開(kāi)發(fā)應(yīng)用微生物來(lái)開(kāi)發(fā)酶的優(yōu)點(diǎn)微生物生長(zhǎng)繁殖快，生活周期短。因此，用微生物來(lái)生產(chǎn)酶產(chǎn)品，生產(chǎn)能力（發(fā)酵）幾乎可以不受限制地?cái)U(kuò)大，能夠滿足迅速擴(kuò)張的市場(chǎng)需求。微生物種類(lèi)繁多，它們散布于整個(gè)地球的各個(gè)角落，而且不同環(huán)境下生存的微生物都有其迥然不同的代謝方式，能分解利用不同的底物。這一特征就為微生物酶品種的多樣性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。第十三頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日微生物酶開(kāi)發(fā)的一般程序樣品采集菌種分離初篩復(fù)篩搖瓶實(shí)驗(yàn)最佳產(chǎn)酶條件組合研究微生物育種物理誘變化學(xué)誘變分子改造酶的制備收集發(fā)酵液收集菌體胞外酶胞內(nèi)酶破碎酶學(xué)研究產(chǎn)品擴(kuò)大指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐保藏菌種第十四頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日一、樣品的采集采樣的目的決定采樣地點(diǎn)的選擇、采樣方法及采樣的數(shù)量。存在目的酶作用底物或潛在作用底物的場(chǎng)所是首選的采樣地。實(shí)例：生物工程中應(yīng)用到的Taq酶就是來(lái)自于從美國(guó)黃石國(guó)家公園100℃硫泉中分離獲得的水生棲熱菌。采樣的另一個(gè)原則就是到特殊或極端環(huán)境中采集樣品，從這些微生物中往往能獲得新酶或具有特殊穩(wěn)定性的酶種。實(shí)例：為了獲得產(chǎn)纖維素酶的目的菌，就可以到垃圾填埋場(chǎng)或長(zhǎng)期堆放纖維材料的地方，甚至食草動(dòng)物的消化道中采樣。第十五頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日菌種的分離是整個(gè)工作的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。分離應(yīng)注意以下幾個(gè)問(wèn)題：分離培養(yǎng)基的確定。分離培養(yǎng)條件的選擇，如培養(yǎng)溫度、濕度、好氧或厭氧培養(yǎng)等；在分離的最初階段一般不給予嚴(yán)密的培養(yǎng)條件，盡可能分離到盡可能多的純菌種。二、菌種的分離第十六頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日三、菌種的初篩

菌種的初篩有兩種方法：

用簡(jiǎn)單的定性反應(yīng)進(jìn)行初篩；在最初分離階段就給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，進(jìn)而讓目的菌株得以繁殖，盡可能地把只成為目的菌的菌株或只將其最適菌株的一株純化分離。

初篩的目的：就是要用最簡(jiǎn)單和最快捷的方法來(lái)對(duì)大量的待篩菌進(jìn)行測(cè)試。

建立有效的初篩模型是最為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。第十七頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日四、菌種的復(fù)篩復(fù)篩的目的是在初篩的基礎(chǔ)上，篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。在復(fù)篩階段，酶活力測(cè)定方法的建立十分重要。最后，應(yīng)該指出，除了可以從自然界中分離獲得目的酶產(chǎn)生菌外，也可以從已經(jīng)保藏的菌種中篩選產(chǎn)酶菌種。這樣做不僅可以節(jié)約大量的人力和物力，而且可以根據(jù)前人的資料和經(jīng)驗(yàn)，了解產(chǎn)酶微生物的類(lèi)別，然后有目的地加以尋找，搜集有關(guān)菌種或相類(lèi)似的微生物，則可達(dá)到事半功倍的效果。第十八頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日五、對(duì)復(fù)篩獲得的菌株的要求對(duì)于經(jīng)過(guò)復(fù)篩之后獲得的高產(chǎn)菌株還應(yīng)在此階段進(jìn)行考察。不能是致病菌。所獲菌株應(yīng)不易變異和退化，不易感染噬菌體。微生物產(chǎn)酶量高，生長(zhǎng)繁殖快。酶的性質(zhì)符合應(yīng)用的需要，而且最好是產(chǎn)胞外酶的菌株。產(chǎn)生的酶便于分離和提純，得率高。營(yíng)養(yǎng)要求低。第十九頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日六、最佳產(chǎn)酶條件的初步確定1.培養(yǎng)方式的確定——固體法；液體法2.最佳培養(yǎng)條件組合3.胞內(nèi)酶和胞外酶胞外酶具有以下一些優(yōu)點(diǎn)：（1）分離提取容易，且不必破碎細(xì)胞，因而也就省去了去除核酸的工藝；（2）胞外酶的生產(chǎn)不受可獲得生物量的限制，因而容易得到較高的酶產(chǎn)量；（3）胞外酶活性顯現(xiàn)的最適條件與產(chǎn)酶菌株的最適生長(zhǎng)條件往往一致。第二十頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日與之相反，以胞內(nèi)酶為商品酶生產(chǎn)的酶源，不僅生產(chǎn)工藝復(fù)雜，而且酶合成量的提高往往受“飽和”效應(yīng)的限制，甚至給細(xì)胞帶來(lái)毒性。

注意：并不是所有的酶都可找到其相應(yīng)的胞外酶產(chǎn)生菌，少數(shù)一些酶就只能在微生物細(xì)胞內(nèi)生成。比如葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶、蔗糖酶、乳糖酶等。另外，用于分子生物學(xué)研究的多聚核苷酸磷酸化酶、核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶、DNA聚合酶等也屬于胞內(nèi)酶。

可采取措施：在實(shí)驗(yàn)室水平上多用凍融、研磨或超聲波法來(lái)破碎細(xì)胞壁。在工業(yè)應(yīng)用上還可通過(guò)控制培養(yǎng)溫度的辦法使細(xì)胞自溶來(lái)獲取目的酶。如釀酒酵母來(lái)生產(chǎn)蔗糖酶就是一個(gè)很好的例子。第二十一頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日

4.微生物酶收集的時(shí)間順序酶的積累發(fā)生在菌體生活周期中的哪一個(gè)階段，隨著各菌種和酶的不同有很大變化。除了延遲期外，在生長(zhǎng)周期中的任何一個(gè)階段，都可以大量出現(xiàn)所需要的酶。在某些情況下，胞外酶在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的早期就開(kāi)始出現(xiàn)，并且在以后的幾個(gè)階段中繼續(xù)增加數(shù)量。胞內(nèi)酶可能主要產(chǎn)生于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，但是，只有在衰亡期，當(dāng)細(xì)胞被溶解時(shí)才釋放到培養(yǎng)基中，因此，通常在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的末期收集細(xì)胞以回收胞內(nèi)酶最為合適，然后再利用菌體自溶、機(jī)械研磨或超聲波處理使酶釋放到提取液中。第二十二頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日方法：七、微生物產(chǎn)酶性能的進(jìn)一步提高1.獲得高產(chǎn)菌種的突變體；2.利用代謝調(diào)節(jié)機(jī)理來(lái)提高微生物的酶產(chǎn)量；3.運(yùn)用遺傳、基因工程的手段將原有菌株中的目的酶基因轉(zhuǎn)移到另外一些對(duì)生產(chǎn)環(huán)境更具有適應(yīng)性的微生物細(xì)胞之內(nèi)使其高效表達(dá)。第二十三頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日微生物酶的提取工作是為進(jìn)一步了解酶的特性、完善酶開(kāi)發(fā)后續(xù)工藝的前提和基礎(chǔ)。酶的提取按照不同的提純要求又可分為酶的粗提及酶的精提。1.酶的粗提工業(yè)生產(chǎn)上用到的微生物酶一般用量都很大，純度要求也不很高。如果待開(kāi)發(fā)的酶是工業(yè)用途的話，則提取方法可以比較粗放。具體的提取流程如下：八、微生物酶的提取方法胞內(nèi)酶的提?。菏占w破碎細(xì)胞收集提取液酶的沉淀分離（鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等）胞外酶的提?。号囵B(yǎng)菌體收集發(fā)酵液液第二十四頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日2.酶的精制用于結(jié)構(gòu)鑒定或其他特殊用途的酶，通常需要精制，其基本流程如下：（1）一般流程粗提酶液脫鹽透析凝膠過(guò)濾濃縮超濾凝膠干燥離子交換濃縮分離離子交換層析凝膠色譜層析純化親和層析等電聚集酶的結(jié)晶（2）一種新型的微生物酶純化手段——制備型聚丙烯酰胺凝膠電泳第二十五頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日對(duì)于無(wú)論用什么方法所獲得的酶高產(chǎn)菌株，都必須對(duì)其進(jìn)行有效的菌種保藏。常見(jiàn)的菌種保藏有以下一些方法：（1）斜面菌種4℃低溫保藏該方法只能作為菌種的短期保藏。九、菌種保藏（2）液體石蠟油保藏（3）沙土管保藏法（4）冷凍保藏法第二十六頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日第二十七頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日工業(yè)用酶的改造（一）理性改造：

計(jì)算機(jī)三維結(jié)構(gòu)模擬預(yù)測(cè)，基因定點(diǎn)突變，改變酶蛋白的某些特性對(duì)酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)，三維空間結(jié)構(gòu)，某種特性的作用機(jī)制比較清楚。第二十八頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日理性改造常用方法：同源模建：氨基酸序列同源性＞25%

常用工具：//SWISS-MODEL.html

第二十九頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日定點(diǎn)突變基于PCR技術(shù)，大引物PCR定點(diǎn)突變?cè)噭┖猩锕径c(diǎn)突變服務(wù)第三十頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日（二）非理性改造----酶的分子定向進(jìn)化在體外模擬自然進(jìn)化的過(guò)程(隨機(jī)突變、重組和選擇),使基因發(fā)生大量變異,并定向選擇出所需性質(zhì)或功能的目的分子

定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+選擇不需了解蛋白的空間結(jié)構(gòu)及某種特性的作用機(jī)制第三十一頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日基因多樣化

選擇擴(kuò)增第三十二頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日1易錯(cuò)PCR(Error-pronePCR)定向進(jìn)化常用方法：改變PCR的反應(yīng)條件，使堿基突變調(diào)整反應(yīng)體系中4種dNTP的濃度增加Mg2+的濃度加入Mn2+使用低保真度的Taq酶枯草桿菌蛋白酶（Chen，1993）：降低反應(yīng)體系中dATP的濃度，酶活提高256倍第三十三頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日2DNA重組（DNAshuffling）創(chuàng)造盡可能多的突變組合更大的變異最佳突變酶β-內(nèi)酰胺酶（Stemme，1994）：抗生素抗性性能提高16,000倍第三十四頁(yè)，共三十六頁(yè)，2022年，8月28日