帖航,乳糖操縱子

乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)及其正負調(diào)控天津商業(yè)大學生物工程類1002班帖航2/6/20231一.乳糖操縱子的提出

大腸桿菌可以利用葡萄糖、乳糖、麥芽糖、阿拉伯糖等作為碳源而生長繁殖，當培養(yǎng)基中含有葡萄糖和乳糖時，細菌優(yōu)先利用葡萄糖，當葡萄糖耗盡，細菌停止生長，經(jīng)過短時間的適應，就能利用乳糖，細菌繼續(xù)呈指數(shù)式繁殖增長。葡萄糖效應（葡萄糖阻遏或分解代謝物阻遏作用），大腸桿菌的2次生長。2/6/20232這種典型的誘導現(xiàn)象，是研究基因表達調(diào)控極好的模型。針對大腸桿菌利用乳糖的適應現(xiàn)象，法國的Jocob和Monod等人做了一系列遺傳學和生化學研究實驗，于1961年提出乳糖操縱子（lac

operon）學說，在1965諾貝爾醫(yī)學生理學獎。Fran?oisJacob

JacquesMonod

2/6/20233二、乳糖操縱子的基本組成

乳糖操縱子：核酸分子上調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性的基本單元，由調(diào)節(jié)基因、啟動子（P）、操作區(qū)（O）、結(jié)構(gòu)基因、和終止子和組成。2/6/20234結(jié)構(gòu)基因群

操縱子中被調(diào)控的編碼蛋白質(zhì)的基因稱為結(jié)構(gòu)基因(structuralgene,SG)。每個結(jié)構(gòu)基因是一個連續(xù)的開放閱讀框(openreadingframe),5’端有起始密碼ATG，3’端有終止密碼TAA、TGA或TAG。

Z基因5’側(cè)具有大腸桿菌核糖體識別結(jié)合位點（RBS）特征的Shine-Dalgarno(SD)序列。由于ｚ、ｙ、ａ三個基因頭尾相接，因而同一個核糖體能沿此轉(zhuǎn)錄生成的多順反子（polycistron）mRNA移動，一氣依次合成這基因群所編碼所有的蛋白質(zhì)。2/6/20235ｚ基因長3510bp，編碼含1170個氨基酸、分子量為135,000的多肽，以四聚體形式組成有活性的β-半乳糖苷酶，催化乳糖轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖(allolactose)，再分解為半乳糖和葡萄糖；ｙ基因長780bp，編碼有260個氨基酸、分子量為30,000的半乳糖透過酶，促使環(huán)境中的乳糖進入細菌；

ａ基因長825bp，編碼275氨基酸、分子量為32,000的轉(zhuǎn)乙?；?，以二聚體活性形式催化半乳糖的乙?；?。

2/6/20236啟動子

啟動子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。操縱子至少有一個啟動子，一般在第一個結(jié)構(gòu)基因5＇側(cè)上游，控制整個結(jié)構(gòu)基因群的轉(zhuǎn)錄。

2/6/20237操縱區(qū)

操縱區(qū)（operator）是指能被調(diào)控蛋白特異性結(jié)合的一段DNA序列，當調(diào)控蛋白結(jié)合在操縱子序列上，會影響其下游基因轉(zhuǎn)錄的強弱。Promotor:-84---+1Operator:-7---+28兩者有7bp重疊，使這段序列可能無法同時結(jié)合RNA聚合酶和阻遏蛋白，也可能雖然可以同時結(jié)合，但無法形成開放的轉(zhuǎn)錄起始復合物2/6/20238調(diào)控基因

調(diào)控基因(regulatorygene)是編碼能與操縱序列結(jié)合的調(diào)控蛋白的基因。調(diào)控蛋白有：阻遏蛋白(repressiveprotein)：與操縱區(qū)結(jié)合后能減弱或阻止其調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄，其介導的調(diào)控方式為負調(diào)控(negativeregulation),

；

激活蛋白(activatingprotein)（或無輔基誘導蛋白（apoinducer)

）：與操縱區(qū)結(jié)合后能增強或起動其調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄，所介導的調(diào)控方式為正調(diào)控(positiveregulation)。乳糖操縱子中，調(diào)控基因lacI位于Plac鄰近，有其自身的啟動子和終止子，轉(zhuǎn)錄方向和結(jié)構(gòu)基因群的轉(zhuǎn)錄方向一致，編碼產(chǎn)生由347個氨基酸組成的阻遏蛋白R。2/6/20239終止子

終止子（terminator，T）是給予RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號的DNA序列。在一個操縱子中至少在結(jié)構(gòu)基因群最后一個基因的后面有一個終止子。2/6/202310

終止子都在結(jié)構(gòu)基因的附近，只能對同一條DNA鏈上的基因表達起調(diào)控作用，這種作用在遺傳學實驗上稱為順式作用（cis-action），啟動子、操縱子和終止子就屬于順式作用元件（cis-actingelement）。調(diào)控基因可以在結(jié)構(gòu)基因群附近、也可以遠離結(jié)構(gòu)基因，它是通過其基因產(chǎn)物──調(diào)控蛋白來發(fā)揮作用的，因而調(diào)控基因不僅能對同一條DNA鏈上的結(jié)構(gòu)基因起表達調(diào)控作用，而且能對不在一條DNA鏈上的結(jié)構(gòu)基因起作用，在遺傳學實驗上稱為反式作用（trans-action），調(diào)控基因就屬于反式作用元件（trans-actingelement），其編碼產(chǎn)生的調(diào)控蛋白稱為反式調(diào)控因子（trans-actingfactor）。由此也可窺測到基因表達調(diào)控機理的關(guān)鍵在蛋白質(zhì)與核酸的相互作用上。2/6/202311二、乳糖操縱子的表達調(diào)控

阻遏蛋白的負調(diào)控CAP的正調(diào)控2/6/2023121.阻遏蛋白的負調(diào)控

當大腸桿菌在沒有乳糖的環(huán)境中生存時，lac操縱子處于阻遏狀態(tài)。此ｉ基因在其自身的啟動子Pi控制下，低水平、組成性表達產(chǎn)生阻遏蛋白R，每個細胞中僅維持約10個分子的阻遏蛋白。R以四聚體形式與操縱子ｏ結(jié)合，阻礙了RNA聚合酶與啟動子Plac的結(jié)合，阻止了基因的轉(zhuǎn)錄起動。R的阻遏作用不是絕對的，R與ｏ偶爾解離，使細胞中還有極低水平的－半乳糖苷酶及透過酶的生成。PstructuralgenesOlacZ

lacY

lacAIR2/6/202313當有乳糖存在時，乳糖受－半乳糖苷酶的催化轉(zhuǎn)變?yōu)閯e乳糖，與R結(jié)合，使R構(gòu)象變化，R四聚體解聚成單體，失去與ｏ的親和力，與ｏ解離，基因轉(zhuǎn)錄開放，使－半乳糖苷酶在細胞內(nèi)的含量可增加1000倍。這就是乳糖對lac操縱子的誘導作用。

β-半乳糖苷酶β-半乳糖苷通透酶β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶lacZ

lacY

lacA別乳糖等誘導物IPOR2/6/2023142.CAP的正調(diào)控

細菌中的cAMP（環(huán)化腺苷酸）含量與葡萄糖的分解代謝有關(guān)，當細菌利用葡萄糖分解產(chǎn)生能量時，cAMP生成少而分解多；相反，當環(huán)境中無葡萄糖可供利用時，cAMP含量就升高。細菌中有一種能與cAMP特異結(jié)合的cAMP受體蛋白CRP(cAMPreceptorprotein)，當CRP未與cAMP結(jié)合時它是沒有活性的，當cAMP濃度升高時，CRP與cAMP結(jié)合并發(fā)生空間構(gòu)象的變化而活化，稱為CAP(CRP-cAMPactivatedprotein)(分解代謝基因激活蛋白)，能以二聚體的方式與特定的DNA序列結(jié)合。

CAP結(jié)合位點（CAPbindingsite）在lac操縱子的啟動子Plac上游端，當CAP與這段序列結(jié)合時，可增強RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性，使轉(zhuǎn)錄提高50倍。相反，當有葡萄糖可供分解利用時，cAMP濃度降低，CRP不能被活化，lac操縱子的結(jié)構(gòu)基因表達下降。2/6/2023152/6/202316由此可見，正調(diào)控與負調(diào)控并非互相排斥的兩種機制，而是生物體為適應環(huán)境而進行的一種協(xié)同機制。

Plac是弱啟動子，單純因乳糖的存在發(fā)生去阻遏使lac操縱子轉(zhuǎn)錄開放，還不能使細菌很好利用乳糖，必需同時有CAP來加強轉(zhuǎn)錄活性，細菌才能合成足夠的酶來利用乳糖。lac操縱子的強誘導既需要有乳糖的存在又需要沒有葡萄糖可供利用。通過這機制，細菌是優(yōu)先利用環(huán)境中的葡萄糖，只有無葡萄糖而又有乳糖時，細菌才去充分利用乳糖。2/6/202317無葡萄糖cAMP濃度高mRNA無乳糖時有乳糖時有葡萄糖cAMP濃度低RNA-polOOOOlac操縱子基因表達既需要乳糖又需缺乏葡萄糖2/6/202318Summary2/6/202319利用lacZ′基因的插入失活篩選重組子

—藍白篩選法

載體同時含氨芐青霉素抗性基因和lacZ′基因，外源基因插在lacZ′基因內(nèi)，受體細胞為lacZ′基因互補菌。在同時含氨芐青霉素和藍白篩選顯色劑（X-gal）的平板上篩選：未轉(zhuǎn)化細胞不能生長；空載體轉(zhuǎn)化菌長成藍色菌落；重組子長成白色菌落。lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶；lacZ′基因編碼β-半乳糖苷酶的N端序列α片段，互補菌染色體上攜帶的缺陷基因編碼C端片斷，兩者互補（α-互補）形成有功能的全酶。補充內(nèi)容2/6/202320X-gal