乙肝病毒DNA實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

LOREMIPSUMDOLOR乙肝病毒DNA的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)2020/12/1811、熒光定量PCR技術(shù)2、乙肝病毒的感染3、HBV-DNA與臨床2020/12/182熒光定量PCR技術(shù)2020/12/183熒光定量PCR技術(shù)Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA的快速擴(kuò)增技術(shù)。PCR技術(shù)通過(guò)兩個(gè)短的稱(chēng)為引物的DNA小片段和一種耐熱酶（TaqDNA聚合酶）的作用，經(jīng)過(guò)高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個(gè)步驟在3個(gè)小時(shí)內(nèi)反復(fù)循環(huán)25-30次，把特定的DNA片段擴(kuò)增1000萬(wàn)倍。每個(gè)PCR體系含4種主要成分：含有待擴(kuò)增序列的DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）2020/12/184

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)PCR終產(chǎn)物的分析，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)未知的起始模版進(jìn)行定量分析的一種技術(shù)，是迄今對(duì)已知基因序列的核酸測(cè)定中最靈敏的方法。熒光定量PCR技術(shù)2020/12/185PCR反應(yīng)過(guò)程5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反應(yīng)組分變性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’2020/12/186延伸5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’3’TaqTaq5’5’重復(fù)退火2020/12/1875’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’循環(huán)24個(gè)拷貝循環(huán)38個(gè)拷貝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’2020/12/188熒光定量PCR原理插入染料法

SYBRGreenI雜交探針?lè)?最常用)

TaqMan2020/12/189TaqMan探針5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’反應(yīng)體系變性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Taql5’3’RQProbe5’3’RQ2020/12/18105’3’5’3’5’3’RQ退火5’3’1.鏈取代Taq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’2.水解3.聚合5’3’QTaqR3’5’4.檢測(cè)熒光5’3’3’QTaqR5’l2020/12/1811乙肝病毒的感染2020/12/1812乙肝病毒的感染

（一）乙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)及特點(diǎn)HBsAg：是HBV感染的主要標(biāo)志HBsAb：保護(hù)性抗體HBcAg：僅存于感染的肝細(xì)胞核內(nèi)，一般不存在于血循環(huán)中HBcAb:非保護(hù)性抗體，HBcAb-IgM提示HBV處于復(fù)制狀態(tài)HBeAg：HBV復(fù)制及強(qiáng)感染性的指標(biāo)HBeAb：有一定的保護(hù)作用，預(yù)后良好2020/12/1813乙肝病毒的感染（二）HBV-DNA與“兩對(duì)半”1.“兩對(duì)半”：機(jī)體的免疫反應(yīng)狀態(tài)；2.“攜帶者”、“大三陽(yáng)”、“小三陽(yáng)”等免疫學(xué)指標(biāo)不能反應(yīng)體內(nèi)病毒復(fù)制水平與感染程度。FQ-PCR：檢測(cè)的是HBV本身的遺傳物質(zhì)—DNA，是病毒存在和復(fù)制的最可靠、最直接的指標(biāo)。HBsAg(－)

HBV-DNA(＋)

HBeAg(－)HBV-DNA(＋)3.血清學(xué)指標(biāo)(－)不能排除HBV感染。2020/12/1814乙肝病毒的感染5.HBeAg陽(yáng)性標(biāo)本HBVDNA檢出率90％左右

HBeAg與HBVDNA有著良好的相關(guān)性4.也可能出現(xiàn)HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。2020/12/1815乙肝病毒的感染2020/12/1816乙肝病毒的感染慢性HBV感染分期及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)魯鳳民，莊輝，乙型肝炎實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展20092020/12/1817HBV-DNA與臨床2020/12/1818HBVDNA檢測(cè)的臨床意義HBVDNA是HBV存在最直接的依據(jù)HBVDNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志HBVDNA是患者具有傳染性的標(biāo)志HBVDNA對(duì)乙肝兩對(duì)半起補(bǔ)充作用HBVDNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)HBVDNA可檢測(cè)出隱匿性慢性乙型肝炎2020/12/1819有利于獻(xiàn)血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷提供直接證據(jù)縮短“窗口期”HBVDNA檢測(cè)的臨床意義2020/12/1820

調(diào)查表明并不是所有“大三陽(yáng)”的病人都處于HBV復(fù)制期，具有傳染性；也不是所有“小三陽(yáng)”的病人HBV都無(wú)復(fù)制。因此，要準(zhǔn)確知道HBV是否處于復(fù)制狀態(tài)，最準(zhǔn)確的方法還是通過(guò)檢測(cè)HBVDNA來(lái)決定。HBVDNA檢測(cè)的臨床意義2020/12/18212020/12/18222020/12/1823HBVDNA檢測(cè)的臨床意義HBsAg和HBeAg均陽(yáng)性而HBVDNA陰性？●干擾素或拉米夫定等治療后病毒復(fù)制受抑制。●PCR所用引物相應(yīng)的DNA序列發(fā)生突變，此引物與突變DNA不能配對(duì)結(jié)合。●病毒DNA整合于宿主肝細(xì)胞染色體而血中游離HBVDNA很少或缺乏。2020/12/1824

目前尚無(wú)一種能迅速、直接殺死清除乙肝病毒的藥物，最好的抗病毒藥物療效也僅能達(dá)到50％左右。目前國(guó)際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類(lèi)：

干擾素：重組人α-1b干擾素、α-2a、