dnaran瓊脂糖凝膠電泳課件

核酸的提取及瓊脂糖凝膠電泳

目錄核酸組成理化性質(zhì)核酸分離、純化的原則核酸提取的基本步驟材料準(zhǔn)備細胞裂解分離、純化沉淀溶解DNA提取的常用方法RNA提取的常用方法核酸的保存瓊脂糖凝膠電泳

核酸DNARNAGenomicDNA(原核、真核、病毒)細胞器DNA(葉綠體、線粒體等)質(zhì)粒DNA(細菌、放線菌等)mRNA(1%-5%)rRNA(80%-85%)tRNA(小分子RNA)(15%-20%)核酸(nucleicacid)核酸的提取是分子生物學(xué)實驗技術(shù)中最重要、最基本的操作。核酸分離、純化原則1、保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性溫度不要太高控制pH值范圍(pH值5-9)

保持一定離子強度減少物理因素對核酸的機械剪切力核酸分離、純化原則核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。所用器械和一些試劑需高溫滅菌提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑2、防止核酸的生物降解DNA酶抑制劑金屬離子螯合劑：

DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，常用EDTA(乙二胺四乙酸)離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。陰離于型表面活性劑

SDS除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物有核酸酶抑制劑作用。1：手指頭

2：槍頭

3：水/緩沖液

4：實驗臺面

5：內(nèi)源Rnase6：RNA樣品

7：質(zhì)粒抽提

8：RNA保存

9：陽離子(Ca,Mg)10：后續(xù)實驗所用的酶Rnase污染的10大來源DNA提取的基本步驟I.材料準(zhǔn)備II.裂解III.分離、純化IV.沉淀或吸附核酸V.溶解材料準(zhǔn)備使用新鮮材料，樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集基因組DNA的提取核酸分離、純化蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；蛋白酶處理核酸分離、純化

多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。核酸沉淀、溶解重新調(diào)整核酸的濃度；去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。核酸的保存(1)對DNA

①DNA樣品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②長期保存樣品中可加入1滴氯仿。(2)對RNA

①RNA樣品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或雙蒸滅菌水中，-70℃保存;②長期保存可以沉淀形式貯于乙醇中;DNA提取的常用方法基因組DNA的提取SDS法其它原理基因組DNA－SDS法SDS在高溫（55～65℃）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。吸附材料結(jié)合法：根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫。快捷高效。低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達到分離目的。其他方法硅質(zhì)材料陰離子交換樹脂磁珠低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。陰離子交換樹脂磁珠低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。陰離子交換樹脂磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達到分離目的。磁珠低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。陰離子交換樹脂磁珠硅質(zhì)材料高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝?。硅質(zhì)材料低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。陰離子交換樹脂高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝?。硅質(zhì)材料陰離子交換樹脂低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。陰離子交換樹脂磁珠磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達到分離目的。磁珠Trizol是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍，酚等物質(zhì)，異硫氰酸胍能迅速溶解蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)破碎。核酸由于核蛋白二級結(jié)構(gòu)的破壞而解離下來。異硫氰酸胍同時抑制細胞釋放出的核酸酶，保持RNA的完整性。TRIZOL法提RNA問題一：DNA降解材料不新鮮、反復(fù)凍融或細胞衰老提取操作過于劇烈，DNA被打斷外源核酸酶污染低溫保存，避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液增加裂解液中螯合劑的含量細胞裂解后操作應(yīng)盡量輕柔試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌DNA分裝保存于緩沖液，避免反復(fù)凍融核酸提取常見的問題問題二：DNA樣品不純DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）RNA提取常見問題二：得率低

樣品太多或太少RNA在柱子上未洗出洗出液中有酒精減少或增加樣品使用量加入RNaseFree,放置幾分鐘再離心漂洗后再次離心RNA提取常見問題三：降解

樣品不新鮮或保存不當(dāng)RNase污染RNA溶液儲存不當(dāng)取新鮮的樣品；取樣后立即放入液氮或儲存液保存研磨樣品及時補充液氮嚴格處理相應(yīng)的器具和試劑-70℃凍存，分裝使用

為了檢測提取核酸的濃度和內(nèi)參，需要繼續(xù)做瓊脂糖凝膠電泳實驗實驗原理（1）DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。分子質(zhì)量越小跑得越快，緊密構(gòu)型快于松散型開環(huán)分子或線性分子，從而可以分離大小不同的DNA或RNA分子。

（2）瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠緩沖液（1）制備凝膠和膠板：

100ml(1×TBE)+1g瓊脂糖（三角瓶），煮膠，溶解，冷卻至60℃(不燙手)，加EB替代物，倒板(4-6mm)，室溫下充分凝固，豎直拔下梳子。（2

）加樣：

5μl質(zhì)粒DNA+1μlloadingbuffer，混勻

5μlPCR產(chǎn)物+1μlloadingbuffer，混勻（3）電泳：電壓80-120V，注意電極方向15min（4）觀察：紫外透射分析儀下觀察。電泳常見問題分析DNA降解：避免核酸酶污染。電泳緩沖液陳舊：電泳緩沖液多次用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。

DNA變性：電泳前勿加熱，可以在電泳儀上面放冰袋，避免溫度高變性條帶淺，Marker彌散了---那要么就是膠的問題，要不就是buffer的問題?；z的時候一定要化勻，buffer盡量用新鮮的

實驗室跑一般都是120V,最多跑到150VDNA電