生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則

生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則—、范圍準確測定生物基質(zhì)（如全血、血清、血漿、尿）中的藥物濃度，對于藥物和制劑研發(fā)非常重要。這些數(shù)據(jù)可被用于支持藥品的安全性和有效性，或根據(jù)毒動學(xué)、藥動學(xué)和生物等效性試驗的結(jié)果做出關(guān)鍵性決定。因此,必須完整地驗證和記錄應(yīng)用的生物分析方法，以獲得可靠的結(jié)果。本指導(dǎo)原則提供生物分析方法驗證的要求，也涉及非臨床或臨床試驗樣品實際分析的基本要求，以及何時可以使用部分驗證或交義驗證，來替代完整驗證。本指導(dǎo)原則二和三主要針對色譜分析方法，四針對配體結(jié)合分析方法。生物樣品定量分析方法驗證和試驗樣品分析應(yīng)符合本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求。應(yīng)該在相應(yīng)的生物樣品分析中遵守GLP原則或GCP原則。二、生物分析方法驗證（一）分析方法的完整驗證分析方法驗證的主要U的是，證明特定方法對于測定在某種生物基質(zhì)中分析物濃度的可靠性。此外，方法驗證應(yīng)采用與試驗樣品相同的抗凝劑。一般應(yīng)對每個新分析方法和新分析物進行完整驗證。當難于獲得相同的基質(zhì)時，可以采用適當基質(zhì)替代，但要說明理由。一個生物分析方法的主要特征包括:選擇性、定量下限、響應(yīng)函數(shù)和校正范圍（標準曲線性能）、準確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、分析物在生物基質(zhì)以及溶液中儲存和處理全過程中的穩(wěn)定性。有時可能需要測定多個分析物。這可能涉及兩種不同的藥物，也可能涉及一個母體藥物及其代謝物，或一個藥物的對映體或異構(gòu)體。在這些情況下，驗證和分析的原則適用于所有涉及的分析物。對照標準物質(zhì)在方法驗證中，含有分析物對照標準物質(zhì)的溶液將被加入到空口生物基質(zhì)中。此外，色譜方法通常使用適當?shù)膬?nèi)標。應(yīng)該從可追溯的來源獲得對照標準物質(zhì)。應(yīng)該科學(xué)論證對照標準物質(zhì)的適用性。分析證書應(yīng)該確認對照標準物質(zhì)的純度，并提供儲存條件、失效日期和批號。對于內(nèi)標，只要能證明其適用性即可，例如顯示該物質(zhì)本身或其相關(guān)的任何雜質(zhì)不產(chǎn)生干擾。當在生物分析方法中使用質(zhì)譜檢測時，推薦盡可能使用穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)標。它們必須具有足夠高的同位素純度，并且不發(fā)生同位素交換反應(yīng)，以避免結(jié)果的偏差。1.選擇性該分析方法應(yīng)該能夠區(qū)分目標分析物和內(nèi)標與基質(zhì)的內(nèi)源性組分或樣品中其他組分。應(yīng)該使用至少6個受試者的適宜的空口基質(zhì)來證明選擇性（動物空白基質(zhì)可以不同批次混合），它們被分別分析并評價干擾。當干擾組分的響應(yīng)低于分析物定量下限響應(yīng)的20%,并低于內(nèi)標響應(yīng)的5%時，通常即可以接受。應(yīng)該考察藥物代謝物、經(jīng)樣品預(yù)處理生成的分解產(chǎn)物以及可能的同服藥物引起干擾的程度。在適當情況下，也應(yīng)該評價代謝物在分析過程中回復(fù)轉(zhuǎn)化為母體分析物的可能性。2.殘留應(yīng)該在方法建立中考察殘留并使之最小。殘留可能不影響準確度和精密度。應(yīng)通過在注射高濃度樣品或校正標樣后,注射空白樣品來估計殘留。高濃度樣品之后在空白樣品中的殘留應(yīng)不超過定量下限的20%,并且不超過內(nèi)標的5%o如果殘留不可避免，應(yīng)考慮特殊措施,在方法驗證時檢驗并在試驗樣品分析時應(yīng)用這些措施，以確保不影響準確度和精密度。這可能包括在高濃度樣品后注射空口樣品，然后分析下一個試驗樣品。定量下限定量下限是能夠被可靠定量的樣品中分析物的最低濃度，具有可接受的準確度和精密度。定量下限是標準曲線的最低點,應(yīng)適用于預(yù)期的濃度和試驗U的。標準曲線應(yīng)該在指定的濃度范圍內(nèi)評價儀器對分析物的響應(yīng)，獲得標準曲線。通過加入已知濃度的分析物（和內(nèi)標）到空口基質(zhì)中，制備各濃度的校正標樣,其基質(zhì)應(yīng)該與LI標試驗樣品基質(zhì)相同。方法驗證中研究的每種分析物和每一分析批,都應(yīng)該有一條標準曲線。在進行分析方法驗證之前，最好應(yīng)該了解預(yù)期的濃度范圍。標準曲線范圍應(yīng)該盡量覆蓋預(yù)期濃度范圍，山定量下限和定量上限（校正標樣的最髙濃度）來決定。該范圍應(yīng)該足夠描述分析物的藥動學(xué)。應(yīng)該使用至少6個校正濃度水平，不包括空口樣品（不含分析物和內(nèi)標的處理過的基質(zhì)樣品）和零濃度樣品（含內(nèi)標的處理過的基質(zhì)）。每個校正標樣可以被多次處理和分析。應(yīng)該使用簡單且足夠描述儀器對分析物濃度響應(yīng)的關(guān)系式?？湛诤土銤舛葮悠方Y(jié)果不應(yīng)參與計算標準曲線參數(shù)。應(yīng)該提交標準曲線參數(shù)，測定校正標樣后回算得出的濃度應(yīng)一并提交。在方法驗證中，至少應(yīng)該評價3條標準曲線。校正標樣回算的濃度一般應(yīng)該在標示值的±15%以內(nèi)，定量下限處應(yīng)該在±20%內(nèi)。至少75%校正標樣,含最少6個有效濃度，應(yīng)滿足上述標準。如果某個校正標樣結(jié)果不符合這些標準，應(yīng)該拒絕這一標樣，不含這一標樣的標準曲線應(yīng)被重新評價，包括回歸分析。最好使用新鮮配制的樣品建立標準曲線，但如果有穩(wěn)定性數(shù)據(jù)支持，也可以使用預(yù)先配制并儲存的校正標樣。5.準確度分析方法的準確度描述該方法測得值與分析物標示濃度的接近程度，表示為：（測得值/真實值）x100%。應(yīng)采用加入已知量分析物的樣品來評估準確度,即質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品的配制應(yīng)該與校正標樣分開進行，使用另行配制的儲備液。應(yīng)該根據(jù)標準曲線分析質(zhì)控樣品，將獲得的濃度與標示濃度對比。準確度應(yīng)報告為標示值的白分比。應(yīng)通過單一分析批（批內(nèi)準確度）和不同分析批（批間準確度）獲得質(zhì)控樣品值來評價準確度。為評價一個分析批中不同時間的任何趨勢，推薦以質(zhì)控樣品分析批來證明準確度，其樣品數(shù)不少于一個分析批預(yù)期的樣品數(shù)。批內(nèi)準確度為了驗證批內(nèi)準確度，應(yīng)取一個分析批的定量下限及低、中、高濃度質(zhì)控樣品,每個濃度至少用5個樣品。濃度水平覆蓋標準曲線范圍：定量下限，在不髙于定量下限濃3倍的低濃度質(zhì)控樣品，標準曲線范圍中部附近的中濃度質(zhì)控樣品，以及標準曲線范圍上限約75%處的高濃度質(zhì)控樣品。準確度均值一般應(yīng)在質(zhì)控樣品標示值的±13%之內(nèi)，定量下限準確度應(yīng)在標示值的土20%范圍內(nèi)。批間準確度通過至少3個分析批，且至少兩天進行，每批用定量下限以及低、中、髙濃度質(zhì)控樣品,每個濃度至少5個測定值來評價。準確度均值一般應(yīng)在質(zhì)控樣品標示值的土13%范圍內(nèi)，對于定量下限，應(yīng)在標示值的±20%范圍內(nèi)。報告的準確度和精密度的驗證數(shù)據(jù)應(yīng)該包括所有獲得的測定結(jié)果，但是已經(jīng)記錄明顯失誤的情況除外。精密度分析方法的精密度描述分析物重復(fù)測定的接近程度，定義為測量值的相對標準差（變異系數(shù)）。應(yīng)使用與證明準確度相同分析批樣品的結(jié)果,獲得在同一批內(nèi)和不同批間定量下限以及低、中、高濃度質(zhì)控樣品的精密度。對于驗證批內(nèi)精密度，至少需要一個分析批的4個濃度，即定量下限以及低、中、高濃度，每個濃度至少5個樣品。對于質(zhì)控樣品，批內(nèi)變異系數(shù)一般不得超過15%,定量下限的變異系數(shù)不得超過20%。對于驗證批間精密度，至少需要3個分析批（至少2天）的定量下限以及低、中、高濃度，每個濃度至少5個樣品。對于質(zhì)控樣品，批間變異系數(shù)一般不得超過15%,定量下限的變異系數(shù)不得超過20%。稀釋可鼎性樣品稀釋不應(yīng)影響準確度和精密度。應(yīng)該通過向基質(zhì)中加入分析物至高于定量上限濃度，并用空口基質(zhì)稀釋該樣品（每個稀釋因子至少5個測定值），來證明稀釋的可黑性。準確度和精密度應(yīng)在±1概之內(nèi)，稀釋的可靠性應(yīng)該覆蓋試驗樣品所用的稀釋倍數(shù)?？梢酝ㄟ^部分方法驗證來評價稀釋可靠性。如果能夠證明其他基質(zhì)不影響精密度和準確度，也可以接受其使用?；|(zhì)效應(yīng)當采用質(zhì)譜方法時，應(yīng)該考察基質(zhì)效應(yīng)。使用至少6批來自不同供體的空口基質(zhì)，不應(yīng)使用合并的基質(zhì)。如果基質(zhì)難以獲得，則使用少于6批基質(zhì)，但應(yīng)該說明理由。對于每批基質(zhì)，應(yīng)該通過計?算基質(zhì)存在下的峰面積（山空口基質(zhì)提取后加入分析物和內(nèi)標測得），與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積（分析物和內(nèi)標的純?nèi)芤海┍戎?計算每一分析物和內(nèi)標的基質(zhì)因子。進一步通過分析物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標的基質(zhì)因子，計算經(jīng)內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子。從6批基質(zhì)計算的內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)不得大于15%。該測定應(yīng)分別在低濃度和高濃度下進行。如果不能適用上述方式,例如采用在線樣品預(yù)處理的情況，則應(yīng)該通過分析至少6批基質(zhì)，分別加入高濃度和低濃度（定量下限濃度3倍以內(nèi)以及接近定量上限），來獲得批間響應(yīng)的變異。其驗證報告應(yīng)包括分析物和內(nèi)標的峰面積，以及每一樣品的計算濃度。這些濃度計算值的總體變異系數(shù)不得大于15%。除正?；|(zhì)外，還應(yīng)關(guān)注其他樣品的基質(zhì)效應(yīng)，例如溶血的或髙血脂的血漿樣品等。穩(wěn)定性必須在分析方法的每一步驟確保穩(wěn)定性，用于檢査穩(wěn)定性的條件，例如樣品基質(zhì)、抗凝劑、容器材料、儲存和分析條件，都應(yīng)該與實際試驗樣品的條件相似。用文獻報道的數(shù)據(jù)證明穩(wěn)定性是不夠的。采用低和高濃度質(zhì)控樣品（空口基質(zhì)加入分析物至定量下限濃度3倍以內(nèi)以及接近定量上限），在預(yù)處理后以及在所評價的條件儲存后立即分析。III新鮮制備的校正標樣獲得標準曲線，根據(jù)標準曲線分析質(zhì)控樣品，將測得濃度與標示濃度相比較，每一濃度的均值與標示濃度的偏差應(yīng)在±1熬范圍內(nèi)。應(yīng)通過適當稀釋，考慮到檢測器的線性和測定范圍，檢驗儲備液和丄作溶液的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性檢查應(yīng)考察不同儲存條件，時間尺度應(yīng)不小于試驗樣品儲存的時間。通常應(yīng)該進行下列穩(wěn)定性考察：?分析物和內(nèi)標的儲備液和工作溶液的穩(wěn)定性；?從冰箱儲存條件到室溫或樣品處理溫度，基質(zhì)中分析物的冷凍和融化穩(wěn)定性;?基質(zhì)中分析物在冰箱儲存的長期穩(wěn)定性；此外，如果適用，也應(yīng)該進行下列考察：?處理過的樣品在室溫下或在試驗過程儲存條件下的穩(wěn)定性；?處理過的樣品在自動進樣器溫度下的穩(wěn)定性。在多個分析物試驗中，特別是對于生物等效性試驗，應(yīng)該關(guān)注每個分析物在含所有分析物基質(zhì)中的穩(wěn)定性。應(yīng)特別關(guān)注受試者采血時，以及在儲存前預(yù)處理的基質(zhì)中分析物的穩(wěn)定性，以確保山分析方法獲得的濃度反映受試者采樣時刻的分析物濃度?？赡苄枰鶕?jù)分析物的結(jié)構(gòu),按具體情況證明其穩(wěn)定性。（二）部分驗證在對已被驗證的分析方法進行小幅改變惜況下，根據(jù)改變的實質(zhì)內(nèi)容,可能需要部分方法驗證。可能的改變包括:生物分析方法轉(zhuǎn)移到另一個實驗室，改變儀器、校正濃度范圍、樣品體積，其他基質(zhì)或物種，改變抗凝劑、樣品處理步驟、儲存條件等。應(yīng)報告所有的改變，并對重新驗證或部分驗證的范圍說明理由。（三）交叉驗證應(yīng)用不同方法從一項或多項試驗獲得數(shù)據(jù)，或者應(yīng)用同一方法從不同試驗地點獲得數(shù)據(jù)時，需要互相比較這些數(shù)據(jù)時，需要進行分析方法的交義驗證。如果可能，應(yīng)在試驗樣品被分析之前進行交義驗證，同一系列質(zhì)控樣品或試驗樣品應(yīng)被兩種分析方法測定。對于質(zhì)控樣品，不同方法獲得的平均準確度應(yīng)在±15%范圍內(nèi)，如果放寬，應(yīng)該說明理山。對于試驗樣品，至少67%樣品測得的兩組數(shù)值差異應(yīng)在兩者均值的±20%范圍內(nèi)。三、試驗樣品分析在分析方法驗證后，可以進行試驗樣品或受試者樣品分析。需要在試驗樣品分析開始前證實生物分析方法的效能。應(yīng)根據(jù)已驗證的分析方法處理試驗樣品以及質(zhì)控樣品和校正標樣，以保證分析批被接受。（一）分析批一個分析批包括空口樣品和零濃度樣品，包括至少6個濃度水平的校正標樣，至3個濃度水平質(zhì)控樣品（低、中、髙濃度雙重樣品，或至少試驗樣品總數(shù)的5%,兩者中取數(shù)LI更多者），以及被分析的試驗樣品。所有樣品（校正標樣、質(zhì)控和試驗樣品）應(yīng)按照它們將被分析的順序，在同一樣品批中被處理和提取。一個分析批包括的樣品在同一時間處理，即沒有時間間隔，山同一分析者相繼處理，使用相同的試劑,保持一致的條件。質(zhì)控樣品應(yīng)該分散到整個批中，以此保證整個分析批的準確度和精密度。對于生物等效性試驗，建議一名受試者的全部樣品在同一分析批中分析，以減少結(jié)果的變異。（二）分析批的接受標準應(yīng)在分析試驗計劃或標準操作規(guī)程中，規(guī)定接受或拒絕一個分析批的標準。在整個分析批包含多個部分批次的情況,應(yīng)該針對整個分析批，也應(yīng)該針對分析批中每一部分批次樣品定義接受標準。應(yīng)該使用下列接受標準：校正標樣測定回算濃度一般應(yīng)在標示值的±15%范圍內(nèi)，定量下限應(yīng)在±20%范圍內(nèi)。不少于6個校正標樣，至少75%標樣應(yīng)符合這些標準。如果校正標樣中有一個不符合標準，則應(yīng)該拒絕這個標樣，重新計算不含該標樣的標準曲線，并進行回歸分析。質(zhì)控樣品的準確度值應(yīng)該在標示值的±15%范圍內(nèi)。至少67%質(zhì)控樣品，且每一濃度水平至少50%樣品應(yīng)符合這一標準。在不滿足這些標準的悄況下，應(yīng)該拒絕該分析批，相應(yīng)的試驗樣品應(yīng)該重新提取和分析。在同時測定兒個分析物的悄況下，對每個分析物都要有一條標準曲線。如果一個分析批對于一個分析物可以接受，而對于另一個分析物不能接受，則接受的分析物數(shù)據(jù)可以被使用，但應(yīng)該重新提取和分析樣品，測定被拒絕的分析物。如果使用多重校正標樣，其中僅一個定量下限或定量上限標樣不合格，則校正范圍不變。所有接受的分析批，每個濃度質(zhì)控樣品的平均準確度和精密度應(yīng)該列表,并在分析報告中給岀。如果總平均準確度和精密度超過15%,則需要進行額外的考察,說明該偏差的理山。在生物等效性試驗情況下，這可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)被拒絕。（三）校正范圍如果在試驗樣品分析開始前，已知或預(yù)期試驗樣品中的分析物濃度范圍窄，則推薦縮窄標準曲線范圍，調(diào)整質(zhì)控樣品濃度，或者適當加入質(zhì)控樣品新的濃度，以充分反映試驗樣品的濃度。如果看起來很多試驗樣品的分析物濃度高于定量上限，在可能的悄況下，應(yīng)該延伸標準曲線的范圍，加入額外濃度的質(zhì)控樣品或改變其濃度。至少2個質(zhì)控樣品濃度應(yīng)該落在試驗樣品的濃度范圍內(nèi)。如果標準曲線范兩被改變，則生物分析方法應(yīng)被重新驗證（部分驗證），以確認響應(yīng)函數(shù)并保證準確度和精密度。（四）試驗樣品的重新分析和報告值選擇應(yīng)該在試驗汁劃或標準操作規(guī)程中預(yù)先確定重新分析試驗樣品的理山以及選擇報告值的標準。在試驗報告中應(yīng)該提供重新分析的樣品數(shù)LI以及占樣品總數(shù)的比例。重新分析試驗樣品可能基于下列理山：?山于校正標樣或質(zhì)控樣品的準確度或精密度不符合接受標準，導(dǎo)致一個分析批被拒絕；?內(nèi)標的響應(yīng)與校正標樣和質(zhì)控樣品的內(nèi)標響應(yīng)差異顯著；?進樣不當或儀器功能異常；?測得的濃度髙于定量上限，或低于該分析批的定量下限，且該批的最低濃度標樣從標準曲線中被拒絕,導(dǎo)致比其他分析批的定量下限高;?在給藥前樣品或安慰劑樣品中測得可定量的分析物；?色譜不佳。對于生物等效性試驗，通常不能接受山于藥動學(xué)理山至新分析試驗樣品。在山于給藥前樣品陽性結(jié)果或者山于藥動學(xué)原因進行重新分析的情況下，應(yīng)該提供重新分析樣品的身份、初始值、重新分析的理山、重新分析獲得值、最終接受值以及接受理山。在儀器故障的悄況下，如果已經(jīng)在方法驗證時證明了重新進樣的重現(xiàn)性和進樣器內(nèi)穩(wěn)定性，則可以將已經(jīng)處理的樣品重新進樣。但對于拒絕的分析批，則需要重新處理樣品。（五）色譜積分應(yīng)在標準操作規(guī)程中描述色譜的積分以及重新積分。任何對該標準操作規(guī)程的偏離都應(yīng)在分析報告中討論。實驗室應(yīng)該記錄色譜積分參數(shù)，在重新積分的情況下,記錄原始和最終的積分數(shù)據(jù)，并在要求時提交。（六）用于評價方法重現(xiàn)性的試驗樣品再分析在方法驗證中使用校正標樣和質(zhì)控樣品可能無法模擬實際試驗樣品。例如，蛋口結(jié)合、已知和未知代謝物的回復(fù)轉(zhuǎn)化、樣品均一性或同服藥物引起的差異，可能影響這些樣品在處理和儲存過程中分析物的準確度和精密度。因此,推薦通過在不同天后，在另外一個分析批中重新分析試驗樣品，來評價實際樣品測定的準確度。檢驗的范圍山分析物和試驗樣品決定，并應(yīng)該基于對分析方法和分析物的深人理解。建議獲得cmax附近和消除相樣品的結(jié)果，一般應(yīng)該重新分析10%樣品，如果樣品總數(shù)超過1000,則超出部分重新分析5%樣品。對于至少67%的重復(fù)測試，原始分析測得的濃度和重新分析測得的濃度之間的差異應(yīng)在兩者均值的土20%范圍內(nèi)。試驗樣品再分析顯示偏差結(jié)果的悄況下，應(yīng)該進行考察,采取足夠的步驟優(yōu)化分析方法。至少在下列情形下，應(yīng)該進行試驗樣品的再分析：?毒動學(xué)試驗,每個物種一次?所有關(guān)鍵性的生物等效性試驗?首次用于人體的藥物試驗?首次用于患者的藥物試驗?首次用于肝或腎功能不全患者的藥物試驗對于動物試驗，可能僅需要在早期關(guān)鍵性試驗中進行實際樣品的再分析，例如涉及給藥劑量和測得濃度關(guān)系的試驗。四、配體結(jié)合分析配體結(jié)合分析主要用于大分子藥物。前述的驗證原則以及對試驗樣品分析的考慮一般也適用。但是由于大分子固有的特點和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，使其難以被提取，所以常常在無預(yù)先分離的情況下測定分析物。此外，方法的檢測終點并不直接來自分析物的響應(yīng),而來自與其他結(jié)合試劑產(chǎn)生的間接信號。配體結(jié)合分析中，每個校正標樣、質(zhì)控樣品以及待測樣品一般都采用復(fù)孔分析。如無特殊說明，本節(jié)以雙孔分析為原則。(―)方法驗證前的考量標準品選擇生物大分子具有不均一性，其中成分的效價與免疫反應(yīng)可能存在差異。因此應(yīng)對標準品進行充分表征。應(yīng)盡量使用純度最高的標準品。用于配制校正標樣和質(zhì)控樣品的標準品應(yīng)盡量與臨床和非臨床試驗使用的受試品批號相同。標準品批號變更時，應(yīng)盡量對其進行表征和生物分析評價，以確保方法性能不變?；|(zhì)選擇一般不推薦使用經(jīng)碳吸附、免疫吸附等方法提取過的基質(zhì)，或透析血清、蛋口緩沖液等替代實際樣品基質(zhì)建立分析方法。但在某些情況下，復(fù)雜生物基質(zhì)中可能存在高濃度與分析物結(jié)構(gòu)相關(guān)的內(nèi)源性物質(zhì)，其高度干擾導(dǎo)致根本無法測定分析物。在無其他可選定量策略的前提下，可允許使用替代基質(zhì)建立分析方法。但應(yīng)對使用替代基質(zhì)建立方法的必要性加以證明?？刹捎锰娲|(zhì)建立標準曲線,但質(zhì)控樣品必須用實際樣品基質(zhì)配制，應(yīng)通過計算準確度來證明基質(zhì)效應(yīng)的消除。最低需求稀釋度的確定分析方法建立與驗證過程中，可能需要對基質(zhì)進行必要的稀釋，以降低其產(chǎn)生的高背景信號。在此悄況下，應(yīng)考察最低需求稀釋度。它是指分析方法中為提高信噪比、減少基質(zhì)干擾、優(yōu)化準確度與精密度而必須使用緩沖液對生物樣品進行稀釋的最小倍數(shù)。應(yīng)使用與試驗樣品相同的基質(zhì)來配制加藥樣品來確定最低需求稀釋度。試劑方法的關(guān)鍵試劑,如結(jié)合蛋口、適配子、抗體或偶聯(lián)抗體、酶等，對分析結(jié)果會產(chǎn)生直接影響，因此須確保質(zhì)量。如果在方法驗證或樣品分析過程中，關(guān)鍵試劑批次發(fā)生改變，須確認方法性能不因此改變,從而確保不同批次結(jié)果的一致性。無論是關(guān)鍵試劑,還是緩沖液、稀釋液、酸化劑等非關(guān)鍵試劑，都應(yīng)對維持其穩(wěn)定性的保障條件進行記錄，以確保方法性能長期不變。（二）方法驗證完整驗證（1）標準曲線與定量范兩標準曲線反映了分析物濃度與儀器響應(yīng)值之間的關(guān)系。在配體結(jié)合分析方法中,標準曲線的響應(yīng)函數(shù)是間接測得的，一般呈非線性，常為S型曲線。應(yīng)使用至少6個有效校正標樣濃度建立標準曲線。校正標樣應(yīng)在預(yù)期定量范圍對數(shù)坐標上近似等距離分布。除校正標樣外，可使用錨定點輔助曲線擬合。驗證過程中，須至少對6個獨立的分析批進行測定,結(jié)果以列表形式報告，以確定標準曲線回歸模型整體的穩(wěn)健性。擬合時，一條標曲允許排除山于明確或不明原因產(chǎn)生失誤的濃度點。排除后應(yīng)至少有75%的校正標樣回算濃度在標示值的±20%（定量下限與定量上限在±25%）范圍內(nèi)。定量下限與定量上限之間的濃度范圉為標準曲線的定量范圍。錨定點校正樣品是處于定量范圍之外的標樣點，用于輔助擬合配體結(jié)合分析的非線性回歸標準曲線，因其在定量范圍之外，可不遵循上述接受標準。（2）特異性特異性是指在樣品中存在相關(guān)干擾物質(zhì)的情況下，分析方法能夠準確、專一地測定分析物的能力。結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)或預(yù)期合用藥物應(yīng)不影響方法對分析物的測定。如在方法建立與驗證階段無法獲取結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)，特異性評價可在最初方法驗證完成后補充進行。應(yīng)采用未曾暴露于分析物的基質(zhì)配制高濃度與低濃度質(zhì)控樣品，加入遞增濃度的相關(guān)干擾物質(zhì)或預(yù)期合用藥物進行特異性考察。未加入分析物的基質(zhì)也應(yīng)同時被測量。要求至少80%以上的質(zhì)控樣品準確度在±20%范兩內(nèi)（如果在定量下限水平，則在±23%范圍內(nèi)），且未加入分析物的基質(zhì)的測量值應(yīng)低于定量下限。（3）選擇性方法的選擇性是指基質(zhì)中存在非相關(guān)物質(zhì)的悄況下，準確測定分析物的能力。山于生物大分子樣品一般不經(jīng)提取，基質(zhì)中存在的非相關(guān)物質(zhì)可能會干擾分析物的測定。應(yīng)通過向至少10個不同來源的基質(zhì)加入定量下限和定量上限水平的分析物來考察選擇性，也應(yīng)同時測量未加入分析物的基質(zhì)。選擇性考察要求至少80%以上的樣品準確度在±20%范圍內(nèi)（如果在定量下限水平，則在±23%范圍內(nèi)），且未加入分析物的基質(zhì)的測量值應(yīng)低于定量下限。如果干擾具有濃度依賴性，則須測定發(fā)生干擾的最低濃度。在此悄況下,可能需要在方法驗證之前調(diào)整定量下限。根據(jù)項LI需要，可能需要針對病人群體基質(zhì)或特殊基質(zhì)（如溶血基質(zhì)或高血脂基質(zhì)）考察選擇性。（4）精密度與準確度應(yīng)選擇至少5個濃度的質(zhì)控樣品進行準確度、精密度以及方法總誤差考察。包括定量下限濃度、低濃度質(zhì)控（定量下限濃度的3倍以內(nèi)）、中濃度質(zhì)控（標準曲線中段）、高濃度質(zhì)控（定量上限濃度75%以上）以及定量上限濃度質(zhì)控。低、中、高濃度質(zhì)控標示值不得與校正標樣濃度標示值相同,質(zhì)控樣品應(yīng)經(jīng)過冷凍，并與試驗樣品采用相同的方法進行處理。不建議采用新鮮配制的質(zhì)控樣品進行精密度與準確度考察。批間考察應(yīng)在數(shù)日內(nèi)進行至少6個獨立的分析批測定。每批內(nèi)應(yīng)包含至少3套質(zhì)控樣品（每套含至少5個濃度的質(zhì)控樣品）。對于批內(nèi)和批間準確度,各濃度質(zhì)控樣品的平均濃度應(yīng)在標示值的±20%（定量下限和定量上限為±25%）范圍內(nèi)。批內(nèi)和批間精密度均不應(yīng)超過20%（定量下限和定量上限為25%）。此外，方法總誤差（即％相對偏差絕對值與％變異系數(shù)之和）不應(yīng)超過30%（定量下限和定量上限為40%）。（5）稀釋線性在標準曲線定量范圍不能覆蓋預(yù)期樣品濃度的悄況下，應(yīng)使用質(zhì)控樣品進行方法的稀釋線性考察，即評價樣品濃度超過分析方法的定量上限時，用空口基質(zhì)將樣品濃度稀釋至定量范圍內(nèi)后，方法能否準確測定。進行稀釋實驗的另一LI的是考察方法是否存在“前帶”或“鉤狀”效應(yīng),即高濃度分析物引起的信號抑制。稀釋線性考察中，稀釋至定量范圉內(nèi)的每個QC樣品經(jīng)稀釋度校正后的回算濃度應(yīng)在標示值的±20%范圍內(nèi)，且所有QC樣品回算終濃度的精密度不超過20%。（6）平行性為發(fā)現(xiàn)可能存在的基質(zhì)效應(yīng)，或代謝物的親和性差異，在可獲得真實試驗樣品的情況下，應(yīng)考慮對標準曲線和系列稀釋的試驗樣品之間進行平行性考察。應(yīng)選取高濃度試驗樣品（最好采用超出定量上限的樣品），用空口基質(zhì)將其稀釋到至少3個不同濃度后進行測定，系列稀釋樣品間的精密度不應(yīng)超過30%o如果存在樣品稀釋非線性的情況（即非平行性），則應(yīng)按事先的規(guī)定予以報告。如果在方法驗證期間無法獲取真實試驗樣品，則應(yīng)在獲得真實試驗樣品后盡快進行平行性考察。（7）樣品穩(wěn)定性應(yīng)使用低、高濃度質(zhì)控樣品考察分析物的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性考察應(yīng)包括室溫或樣品處理溫度下的短期穩(wěn)定性，以及凍一融穩(wěn)定性。此外，如果試驗樣品需要長期凍存，則應(yīng)在可能凍存樣品的每個溫度下進行長期穩(wěn)定性考察。每一濃度質(zhì)控樣品應(yīng)有67%以上的樣品濃度在標示值的±20%范圍內(nèi)。（8）商品化試劑盒商品化試劑盒可以用來進行試驗樣品分析，但使用前必須按本指導(dǎo)原則的要求對其進行驗證。部分驗證和交義驗證在二、（二）和二、（三）中敘述的關(guān)于驗證的各項內(nèi)容都適用于配體結(jié)合分析。（三）試驗樣品分析分析批配體結(jié)合分析中最常使用微孔板，一個微孔板通常為一個分析批。每個微孔板應(yīng)包含一套獨立的標準曲線和質(zhì)控樣品，以校準板間差異。在使用某些平臺時，單個樣品載體的通量可能有限，此時允許一個分析批包含多個載體?？稍谠摲治雠氖讉€與末個載體各設(shè)置一套標準曲線，同時在每一載體上設(shè)置質(zhì)控樣品。所有樣品均應(yīng)復(fù)孔測定。試驗樣品分析的接受標準對于每個分析批，除錨定點外，標準曲線須有75%以上的校正標樣（至少6個）回算濃度在標示值的±20%（定量下限和定量上限為±25%）范圍內(nèi)。每塊板應(yīng)