單克隆抗體藥物不穩(wěn)定性因素和改善措施,生物制藥論文

單克隆抗體藥物不穩(wěn)定性因素和改善措施,生物制藥論文摘要：單克隆抗體藥物是生物藥物的重要分支，因其靶向性、特異性高而遭到廣泛關注。隨著單克隆抗體技術的不斷發(fā)展，抗體藥物在疾病預防、診斷和治療方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。但是，抗體藥物作為一種人工合成蛋白質的天然屬性，其在生產、儲存及體內使用經過中，容易遭到體內外復雜環(huán)境的物理和化學方面的影響，發(fā)生多種形式的理化性質改變，進而導致其免疫原性增加，半衰期縮短，甚至失效。因而怎樣提升抗體藥物的穩(wěn)定性，降低免疫原性，延長半衰期，提高其體內生物利用度是當前抗體藥物應用中亟待解決的關鍵問題。本文從影響抗體穩(wěn)定性的因素〔構造、環(huán)境及制備工藝〕、理化機制以及提高抗體穩(wěn)定性的方式方法等幾個方面，對最近文獻報道的相關研究進行扼要的綜述。本文關鍵詞語:單克隆抗體;理化因素;穩(wěn)定性提高;生物制藥;Abstract：Monoclonalantibody(mAb)drugshaveattractedwidespreadattentionfortheirhightargetingandspecificityasanimportantbranchofbiopharmaceutics.WiththerapiddevelopmentofmAbdrugs,theyplayanirreplaceableroleindiseaseprevention,diagnosisandtreatment.Whileasakindoflargesyntheticmolecule,duetoitsnaturalattribute,themAbiseasytobeaffectedinstabilitybythephysicochemicalfactorsinvitroandvivoduringmanufacturing,storageandapplication.VariousformsofphysicalandchemicalpropertieschangeofmAbwillleadtoincreasedimmunogenicity,shortenedhalf-life,andevenfailure.Therefore,howtoimprovethestability,reduceimmunogenicity,extendhalf-life,andthenincreasebioavailabilityisakeyissuethatneedstobeurgentlysolvedintheapplicationofantibodydrugs.Thisarticlereviewthelatestresearchaboutthefactorsincludingproteinstructure,environmentalstress,manufacturingtechniquethataffecttheantibodystability.Besides,themechanismandthemethodsofoptimizationarealsoreferred.Keyword：Monoclonalantibody;Physicochemicalfactors;Stabilityimprovement;Biopharmaceutical;在過去的30年里，單克隆抗體〔monoclonalanti?body,mAb〕的研發(fā)和優(yōu)化技術已經獲得了長足的發(fā)展，現前階段治療性單克隆抗體藥物已經廣泛應用于本身免疫病、腫瘤以及病毒感染等疾病的臨床治療或預防，且已成為生物制品類藥物中發(fā)展最快的一類。學者們在長期研究中除了重點關注抗體構造的優(yōu)化，還針對抗體穩(wěn)定性的各種影響因素提供了眾多解決方案，以此降低抗體藥物的開發(fā)、儲存成本，并提高其臨床療效[1,2,3]。本文扼要回首了近些年單克隆抗體穩(wěn)定性的影響因素和理化機制以及抗體穩(wěn)定性改造方案等方面的研究進展。1、抗體分子構造及穩(wěn)定性研究意義1.1、抗體分子構造抗體是指由機體產生能與抗原特異性結合的免疫球蛋白?？贵w由B淋巴細胞轉化而來的漿細胞分泌產生，每個B淋巴細胞株只能產生一種它專有的、針對一種特異性抗原決定簇的抗體。這種從一株單一細胞系產生的抗體就叫單克隆抗體〔mAb〕，簡稱單抗。常規(guī)的單抗分子是由兩條重鏈〔HC〕及兩條輕鏈〔LC〕通過鏈間二硫鍵連接成“Y〞形構造〔圖1〕，它又可分為3個功能組分：兩個抗原結合片段〔Fab〕和一個結晶區(qū)〔Fc〕，兩個Fab通過鉸鏈區(qū)連接到Fc，且構象變化相比于Fc更為靈敏。來歷自重鏈和輕鏈的一對可變區(qū)〔VH和VL〕組成Fab的Fv區(qū)，通常Fv區(qū)被糖基化修飾，是決定抗體怎樣與適應性免疫及體液免疫系統中的其他成分互相作用的關鍵。1.2、穩(wěn)定性研究意義研究發(fā)現，某些單克隆抗體藥物固然在體外實驗中表現出良好的藥物活性，但在進入臨床試驗階段卻會遭碰到體內活性降低的問題[4]。因而在藥物研發(fā)的初期就要兼顧其藥效動力學的問題?？贵w藥物的穩(wěn)定性是影響抗體藥效動力學的關鍵因素之一，首先抗體的高親和力與高特異性都需要以穩(wěn)定的構造為基礎，這是其正確行使生物學功能的保障。其次，抗體的穩(wěn)定性越高，則其新生肽鏈在細胞內裝配時產生錯誤折疊〔mis-folding〕的概率越低，可溶性表示出量也越高[5]。良好的熱穩(wěn)定性所帶來的緊湊構造使抗體的蛋白酶切位點更不易暴露，并其影響藥品保質期及存放條件，關系到藥物成本。當前，提高蛋白質熱穩(wěn)定性的方式方法主要有非共價修飾、化學修飾、添加蛋白質穩(wěn)定劑、蛋白質工程，以及在液體狀態(tài)利用礦化技術直接在蛋白外表構成磷酸鈣礦化外殼以提高蛋白質的穩(wěn)定性[6]。由此可見，在保證抗體親和力及表示出量等性質不受太大影響的情況下，最大程度上提高其穩(wěn)定性，對抗體藥物的研發(fā)具有重要的現實意義。圖1完好IgG抗體帶狀圖[蛋白構造數據庫〔PDB);ID:1igt]Fig.1CompletestructureofIgG[From:ProteinDataBank(PDB);ID:1igt]2、影響抗體穩(wěn)定性的因素2.1、抗體分子本身性質抗體分子一級構造〔蛋白序列〕對其聚集性有著重要影響，例如當抗體分子的等電點〔pI〕過高或過低時決定簇互補區(qū)〔com?plementarity-determiningregion,CDR〕都會促進聚集，不同的是較低pI的分子所產生的分子間靜電互相作用構成了可溶的聚集物，而較高pI的分子，尤其是當和帶有負電荷的容器外表接觸時，則會構成沉淀性聚集[7]。例如有研究比擬了英夫利昔單抗〔infliximab〕及其仿制藥在強迫性降解試驗〔forceddegradation〕中的表現[8]，發(fā)現二者盡管在生產工藝和制造經過上有些許不同，但在該試驗中并未表現出明顯差異，講明一級構造仍然在很大程度上決定了抗體分子的穩(wěn)定性。還有研究比擬了IgG分子的3個亞型〔IgG1、IgG2、IgG4〕在分別經過酸性處理〔pH=3.3〕之后的表現，結果IgG1保持了單體形式，而另外兩個亞型均表現出二聚化傾向，且當恢復到正常pH時導致IgG4構成聚集體[9]。該結果與pH在4～7范圍內IgG亞型聚集性〔IgG1IgG2IgG4〕的強弱比照相印證[10]。KERR等[11]通過高分辨率質譜分析了治療性抗體高級構造〔HOS〕對曲妥珠單抗、貝伐珠單抗及利妥昔單抗藥物儲存的影響，發(fā)現貝伐珠單抗可變區(qū)和恒定區(qū)在特定溫度下存在肽鍵水解。2.2、環(huán)境應力因素溫度：高溫能夠毀壞單抗構造，且通常不可逆，進而導致聚集；同時伴隨溫度增高，脫酰胺和氧化反響發(fā)生的概率也增加[12]。當環(huán)境溫度下有50%左右的蛋白天然構造展開時，將該溫度定義為熔解溫度〔meltingtemperature,Tm〕，每種蛋白都有其Tm，一般該溫度范圍為40℃～80℃之間，而通常生物藥品儲存運輸的溫度在2℃～8℃之間，遠低于該溫度[13]。除此之外過低溫也會引起蛋白變性，尤其是在反復凍融的情況下。隨著凍融次數增加，會出現緩沖液pH值下降、溶質分子濃縮、水冰界面構成等因素的影響[14]。當0.5mg/ml貝伐珠單抗〔bevacizumab〕溶液經受1～30次凍融循環(huán)時，其單體峰通過〔sizeexclusionchromatography,SEC〕分析，發(fā)現隨著循環(huán)次數的增加而降低。在類似的研究中，對于固定數量的循環(huán)凍融〔10個循環(huán)〕，單體峰值隨著貝伐珠單抗?jié)舛鹊脑黾佣档停@表示清楚在較高濃度下凍融循環(huán)的穩(wěn)定性有所提高[15]。光照：蛋白質的芳香族殘基〔以色氨酸殘基為主〕對光照非常敏感，易發(fā)生光氧化構成氧化自由基，隨后發(fā)生斷裂和交聯，尤其是紫外光相較于白光影響更大[16]。有研究證實光照對蛋白質二級和三級構造的影響取決于其存在形式，通常凍干粉比液體制劑更能耐受光照。LUIS等[17]通過采用ICHQ1B(InternationalCouncilforHarmonisation,ICHQ1Bconditions〕推薦值〔132萬勒克斯小時〕和環(huán)境光照強度〔24萬勒克斯小時〕評估了兩種單克隆抗體的光穩(wěn)定性，結果顯示出宏大的差異，表示清楚單抗藥物的光穩(wěn)定性取決于總的曝光量而不是光強度。SHAH等[18]發(fā)現了在ICH光照條件下固然總體上未觀察到明顯的抗體構造變化，但CH2構造域仍然存在降解。蛋白質藥物主要的光暴露發(fā)生在儲存運輸和給靜脈輸液患者用藥期間，因而在藥品應用階段躲避這一因素的影響就顯得尤為重要。機械應力：在單抗藥物生產使用經過中還會遭到機械應力〔如攪拌或剪切力〕的影響。研究證實由于疏水性基團〔主要是巰基〕暴露，在該經過中構成了大量規(guī)格在1.5～80μm不等的聚集體，且聚集水平與氣-液界面積呈指數關系[19]。藥物制劑在通過輸液管或注射器時會產生剪切力作用，已有研究報道了高濃度單抗溶液的剪切稀化現象〔剪切力下黏度的降低〕，這可能與本身聚集的單抗分子解離有關，但當前尚不清楚過濾經過中的剪切力能否會引起其他改變[20]。2.3、存儲方式因素濃度：高濃度下的單抗制劑由于黏度增加，分子間互相作用加強也會促進聚集[21]。HAUPTMANN等[22]發(fā)現高濃度僅僅會增加制劑中小顆粒的數量，而分子量大的聚集物反而減少了；NICOUD等[23]則觀察到聚集物隨濃度增加而增加的現象。有研究指出，固然降低抗體濃度能夠使結合性較弱的聚集體解離，但若不同時改變抗體分子與輔料的比例，則會稀釋藥物制劑中的輔料〔具有保衛(wèi)性的糖類、外表活性劑或精氨酸〕，影響了溶液本身的pH值和離子強度，導致抗體分子化學穩(wěn)定性降低[24]。除此之外，蛋白質分子本身具備聚合傾向，是由分子間的電荷互相作用所主導，且受溶液的離子強度影響[25]。包裝：除對單抗藥物固有屬性及構造的優(yōu)化外，也不能忽略在現有生產條件下包裝存儲方式的影響。蛋白質作為外表活性分子，有吸附到疏水界面的傾向進而導致產品損失、效力降低和潛在的劑量缺乏[26]。KUMRU等[27]的研究結果表示清楚聚氯乙烯〔PVC〕材質的輸液袋〔Ⅳ-bags〕相較于聚烯烴材質對1mg/ml的IgG4溶液吸附效果更明顯，且顆粒物和渾濁度明顯增加，而在參加聚山梨酯20后兩種輸液袋中的顆粒數降低至接近陰性對照。3、影響抗體不穩(wěn)定性的機制造成抗體不穩(wěn)定性的因素大致劃分為化學不穩(wěn)定性因素和物理不穩(wěn)定性因素。它們各自對抗體性質產生影響，且相互互相作用：相關化學反響可導致物理不穩(wěn)定性[13]，物理不穩(wěn)定性又可使某些活潑踴躍的化學基團產生變化，或將有可能互相作用的基團間距離拉近[28]。3.1、化學不穩(wěn)定性的作用機制氧化作用：化學降解不僅不利于抗體藥物的儲存，在應用中還會使藥物有效性發(fā)生損耗。氧化反響〔包括二硫鍵的構成〕是最常見的引起化學降解的因素，這種氧化能夠發(fā)生于氧化劑〔例如：光照、過氧化物或者活潑金屬〕存在的情況下，可以以自發(fā)氧化的形式產生[29]?？贵w分子中相當一部分氨基酸基團易被氧化，例如甲硫氨酸、組氨酸和半胱氨酸[29,30]。二硫鍵的構成即發(fā)生在兩個半胱氨酸的巰基之間，且類似的氧化不僅可發(fā)生在單個分子內部，可以在分子間產生。脫酰胺作用：另一個引起降解的因素便是脫酰胺化，牽涉含天冬酰胺〔Asn〕和谷氨酰胺〔Gln〕殘基的位點。脫酰胺化類似于酸堿反響，是在鄰近反響位點的質子供體〔通常為絲氨酸或者蘇氨酸〕介入下構成環(huán)酰亞胺中間物，進而毀壞抗體本身的構造[31]。例如Asn經脫酰胺化往往生成琥珀酰亞胺，之后很快自發(fā)水解為天冬氨酸或異天冬氨酸〔Asp〕。水解作用：在抗體分子中另一大化學性質不穩(wěn)定因素便是二硫鍵或肽鍵的斷裂[29]。華而不實在單抗藥物正常使用經過中“單價抗體〞的構成就是由二硫鍵斷裂導致[29]。而肽鍵斷裂則構成大量性質和大小不一的小分子量片段，且尚不能確定該現象是由酶解導致。同樣的，抗體分子中鉸鏈區(qū)的水解機制亦不明確，例如在研究木瓜蛋白酶對單抗裂解的經過中參加蛋白酶抑制劑并不能改變抗體分子的斷裂，因而揣測可能是由某種非酶解機制導致的該現象。盡管詳細機制尚不明確，但抗體分子這一降解途徑通常發(fā)生在強酸或者高溫環(huán)境中[30]。輔料作用：除了上述可能由環(huán)境影響發(fā)生的降解外，糖類作為常用的輔料亦會對抗體分子產生影響。研究發(fā)現蛋白質在復原糖作用下可發(fā)生糖基化〔glycosylation〕，最終構成酮胺而導致褐變，且從抗體在胞內克隆直至靜脈注射，該反響都有可能發(fā)生[31,32]。固然如今大多廠商以非復原糖作為輔料，但其仍然能夠降解為復原糖進而影響單抗藥物構造和功能[32]。化學修飾對于單抗藥物性質的影響程度取決于其修飾位點[33]。例如，脫酰胺化在Fc段發(fā)生所造成的影響很小，但若發(fā)生在CDR上則會降低單抗的親和力及效價；同樣的，氧化反響若是發(fā)生在Fc段則不僅會降低結合親和力，更會增加單抗在人體內的去除率進而降低血藥濃度[34]。一些研究表示清楚，化學不穩(wěn)定性還會導致蛋白構象的改變和分子聚集，例如甲硫氨酸氧化易引起二級構造穩(wěn)定性改變。3.2、物理不穩(wěn)定性相關機制蛋白質變性往往意味著高級構造的展開，上述化學不穩(wěn)定性改變、環(huán)境因素〔溫度及pH〕等都有可能導致這一結果，并隨之降低抗體鉸鏈區(qū)的活動性，增加聚集性[29]。聚集性增加是最主要的物理不穩(wěn)定性改變，聚集體由多個蛋白質分子通過非共價鍵〔范德華力、氫鍵、疏水和靜電互相作用〕相鏈接，而不牽涉一級構造和蛋白序列的變化。除此之外還有部分聚集體是通過二硫鍵等共價鍵相締合，稱為共價聚集[13]。這兩種聚集最終都有可能構成可溶性或不可溶性聚集物。抗體的聚集大多都是不可逆的，尤其是在后期當構成的聚集物是由大量非天然構造的抗體分子組成的時候[35]。有學者提出了抗體聚集物有可能通過兩種途徑使正在接受單抗類藥物治療的患者產生免疫原性：T細胞依靠途徑以及細胞因子激活途徑。而且分子量越大的聚集物其免疫原性越強，且糖基化程度、聚集產物來源等亦對其有影響[2,36,37]。最終，免疫原性反響不僅大幅降低了藥物的體內療效，而且易引發(fā)Ⅰ型超敏反響。當然，上述現象僅在體外實驗及動物模型中觀察到，并預測了聚集物在人體內的風險效應，其詳細的機制仍然有待探究[38]。4、抗體穩(wěn)定性評估方式方法生物技術產品穩(wěn)定性評估通常包括生物活性分析、分子構造和純度分析〔含降解產物的定量檢測〕以及相關參數的監(jiān)測〔如外觀、pH值等〕，綜合以上數據來對樣品的熱穩(wěn)定性、聚集性和分子間作用力大小做出評估。在對抗體效價和穩(wěn)定性進行評估的方式方法中，除了最常用的間接ELISA法外，還常應用差示掃描量熱儀〔DSC〕測量蛋白質熱穩(wěn)定性，其不僅能夠得到熔化溫度，還能夠得到與熔化有關的焓、熵和自由能[39]。進一步發(fā)展而來的差示掃描熒光法〔DSF〕、圓二色〔CD〕光譜法、動態(tài)光散射〔DLS〕檢測技術都朝著高通量、高精度或者對蛋白質水動力學監(jiān)測等方向改良[40]。除此之外在蛋白質溶解性預測方面，研究者們相繼提出了穿插作用色譜法〔CIC〕、親和捕獲本身互相作用-納米粒子光譜法〔AC-SINS〕或克隆本身互相作用-生物層干預法〔CSI-BLI〕等技術，獲得了一定的進展，這些方式方法評估單克隆抗體在低蛋白濃度下的穿插或本身互相作用的可能性，進而預測單克隆抗體在高濃度下的特性。隨著計算機輔助設計在生物大分子開發(fā)中的應用，對不確定晶體構造的分子，能夠利用大量的建模和仿真軟件來預測抗體-抗原復合物的三維構造；可以使用不同的力場進行分子動力學〔molec?ulardynamics,MD〕模擬[41]，獲得更多有關結合互相作用、穩(wěn)定性的具體信息，并使非共價鍵能〔疏水能、靜電能、非極性能和結合能〕的計算變得更容易。5、穩(wěn)定性改造方案5.1、抗體分子構造改造基于抗體分子易受化學修飾位點進行構造改造，一直以來是其穩(wěn)定性優(yōu)化的重要方向。華而不實抗體CDR區(qū)的去酰胺作用可能導致對抗原結合功能喪失，已有研究逐步說明去酰胺化和化學修飾的機制以及它們的影響。且有研究證實Gln的脫酰胺速率比Asn慢得多，因而，通過將Asn突變?yōu)镚ln來移除脫酰胺位點或者降低脫酰胺效應的發(fā)生概率被視為一種解決方案[42]。研究還發(fā)如今一級序列中緊跟在Asn后面的氨基酸類型被以為是脫酰胺傾向的重要決定因素，若采用側鏈較大的氨基酸〔通常為纈氨酸和異亮氨酸〕替代能夠使得Asn對脫酰胺作用的抵抗力更強[42]。本課題組前期工作中利用計算機分子模建系統發(fā)現HER2抗體赫賽汀〔Herceptin)LC-Asn30和HC-Asp102兩個脫酰胺和異構化的降解熱門，經同性突變?yōu)長C-Gln30和HC-Glu102后，抗體穩(wěn)定性得到明顯提高且原有生物學活性沒有發(fā)生改變[43]。除此之外，抗體特定位點的糖基化修飾，決定其不同效應配體的功能，同時糖基化能夠加強單克隆抗體藥物的穩(wěn)定性和溶解性，并能降低單克隆抗體藥物的聚集趨勢[44]。HIGEL等[44]使用多變量數據分析評估了單克隆抗體糖基化與培養(yǎng)液中氨基酸種類及數量的關系，為今后在細胞培養(yǎng)經過中進行控制糖型的研究提供了新思路。THARMALINGAM等[45]通過一種新型的實時糖基化監(jiān)測儀器〔微量順序注射系統與超高效液相色譜相結合〕研究Mn2+濃度對抗體糖基化的影響，實現了通過調節(jié)培養(yǎng)基中Mn2+濃度來控制產物糖型構造，為糖基化研究提供了新方式方法。SHA等[46]基于生產工藝的改良，通過代謝分析和數學模型相結合的方式方法進一步控制了重組蛋白的糖基化程度，實現了對產物效應功能的優(yōu)化。5.2、生產工藝優(yōu)化有研究指出，過酸或過堿條件下抗體都會發(fā)生不同途徑的降解[47]。在pH6.8靜脈注射用免疫球蛋白〔IGIV〕制劑中，這種由pH導致的不穩(wěn)定性通過參加麥芽糖穩(wěn)定劑能夠得到改善；而在以CHO細胞系為表示出系統的體系中，HOGIRI等[48]建立以活細胞數、凋亡細胞數、死細胞數、產物量〔mAb〕，培養(yǎng)體積和pH值等6大參數為主體的pH依靠性動力學模型，用數值優(yōu)化方式方法來估計整個細胞培養(yǎng)時間內的pH值變化規(guī)律，進而在生產階段制定出有效的pH優(yōu)化策略。外表活性劑通常被添加到單抗藥物配方中，以減少疏水區(qū)的暴露，或者通過競爭吸附位點進而減少蛋白質互相作用和界面誘導的聚集，華而不實常用的非離子外表活性劑有聚山梨酯20和聚山梨酯80[49]。除此之外，某些氨基酸也常被作為賦形劑用以保衛(wèi)聚集，常用的精氨酸〔Arg〕能夠增加蛋白質的溶解度，并能保衛(wèi)其免受光照和高溫誘導的聚集。TOTH等[50]證實了〔Arg〕氫氯化物能夠提升熱穩(wěn)定性，同時減少攪拌誘導的聚集。脯氨酸〔Pro〕作為一種環(huán)狀氨基酸，被以為通過與芳香殘基和暴露的疏水區(qū)結合而加強mAb的溶解，進而降低蛋白質-蛋白質的互相作用和溶液黏度，減少其pH值在pI附近時的聚集[51]。而通過對抗體藥物成品在儲存或包裝方式上的改良往往更具經濟性。SREEDHARA等[52]研究表示清楚，去除輸液袋的頂部空隙能夠減少攪拌誘導的聚集體構成；除此之外容器對藥物溶液中的輔料〔緩沖液、外表活性劑、防腐劑、其他穩(wěn)定劑等〕的吸附也會導致它們濃度的降低進而不再知足單抗藥物穩(wěn)定性的要求。迄今為止防止蛋白質與容器外表互相作用的方式方法是對外表進行涂層，即外表鈍化。涂層大致可分為兩類：單層涂層〔較常用〕和多層涂層〔不太可控〕，較常用的涂層聚合物包括乙二醇或環(huán)氧乙烷[53]。除此之外，若使用帶極性或中性電荷的聚合物涂層也能夠減少蛋白質的吸附[54]6、結束語治療性單克隆抗體藥物是當下生物醫(yī)藥領域的研發(fā)熱門，且以此為基礎開發(fā)出的單鏈抗體〔scFv〕、單域抗體、抗體-藥物偶聯物〔ADC〕等應用于各器官系統疾病的藥物也相繼獲批上市。怎樣在不改變藥物靶向性、兼顧療效和免疫原性的同時提高藥物本身穩(wěn)定性，盡可能延長藥物半衰期，保持有效的血藥濃度是當下亟待解決的問題?？贵w穩(wěn)定性遭到環(huán)境、配方、本身構造及生產操作等多種因素影響，而對抗體穩(wěn)定性的有效評估是進行個體化改造的前提。穩(wěn)定性評估不應僅僅根據有無降解產物或穩(wěn)定性分子的濃度來定義，而應該包含下面3方面：物理穩(wěn)定性研究的評估應該涵蓋聚集體和碎片數目以及單抗構造；化學穩(wěn)定性研究應關注蛋白降解情況；生物穩(wěn)定性研究應保證單克隆抗體對靶點的活性與其物理化學穩(wěn)定性保持一致。深切進入討論抗體穩(wěn)定性影響因素及評估方式方法，有助于抗體藥物的合理優(yōu)化以及新藥的研發(fā)。以下為參考文獻[1]MANNINGMC.,CHOUDK,MURPHYBM,etal.Stabilityofproteinpharmaceuticals:Anupdate[J].PharmRes,2018.27(4):544-575.DOI:10.1007/s11095-0090045-6.[2]UCHIYAMAS.Liquidformulationforantibodydrugs[J].BiochimBiophysActa,2020,1844(11):2041-2052.DOI:10.1016/j.bbapap.2020.07.016.[3]WADAR,MATSUIM.KAWASAKIN.InfuenceofN-glycosylationoneffectorfunctionsandthermalstabilityofglycoengineeredlgG1monoclonalantibodywithhomogeneousglycoforms[J].MAbs,2022.11(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