中藥制劑分析-第四章-衛(wèi)生學檢查醫(yī)學課件

第四章中藥制劑的衛(wèi)生學檢查第一節(jié)概述第二節(jié)微生物限度檢查法第三節(jié)活螨檢查法第四節(jié)熱原檢查法第五節(jié)無菌檢查法第六節(jié)細菌內(nèi)毒素檢查法第一節(jié)概述一、細菌二、真菌一、細菌（一）細菌1.細菌的大小與基本形態(tài)細菌個體微小，通常以微米(μm)為計量單位。需用顯微鏡放大幾百倍或上千倍才能看到。各種細菌大小不一，同種細菌也因菌齡和環(huán)境不同而有差異。細菌的種類不同，形態(tài)也多種多樣，其基本形態(tài)有三類：即球菌、桿菌和螺形菌。2.細菌的結(jié)構(gòu)各種細菌共有的結(jié)構(gòu)包括細胞壁、細胞膜、細胞質(zhì)、核質(zhì)等。細胞壁是細菌的最外層結(jié)構(gòu)，與細胞膜緊密相連。其主要功能是維持細菌的形態(tài)，保護細菌，與細胞膜共同完成菌體內(nèi)外的物質(zhì)交換。革蘭氏陽性菌細胞壁較厚，其主要成分為肽聚糖、磷壁酸和少量表面蛋白質(zhì)；革蘭氏陰性菌細胞壁較薄，肽聚糖含量少，肽聚糖外層還有由脂蛋白和脂多糖組成的多層結(jié)構(gòu)。細胞膜位于細胞壁內(nèi)側(cè)，是半滲透性生物膜，主要成分是蛋白質(zhì)、磷脂和少量的糖。膜上有許多特異性的酶，可高度選擇性地吸收營養(yǎng)物質(zhì)，排泄廢物，維持滲透壓平衡。細胞質(zhì)為無色透明的膠狀物質(zhì)，基本成分為水、無機鹽、核酸、蛋白質(zhì)和脂類等。細胞質(zhì)內(nèi)常含有核蛋白體、質(zhì)粒和胞漿顆粒等多種內(nèi)含物。細菌的細胞核沒有核膜和核仁，但在細胞漿中有固定的核區(qū)，稱核質(zhì)。核質(zhì)是由裸露的雙股脫氧核糖核酸鏈組成的，主要功能是控制細菌的遺傳和變異性狀。某些細菌具有莢膜、芽胞、鞭毛和菌毛。其中芽胞對熱、干燥、化學藥品與輻射均有較強的抵抗力。因此，在消毒滅菌時應(yīng)以殺死芽胞作為徹底滅菌的指標。一、細菌(4)染色：根據(jù)檢驗目的的不同，選用不同的染色方法進行染色。①單染法：只用一種染料染色，如常用的美藍染色。單染法只能將各種細菌染成一種顏色，可觀察細菌的大小與排列，不能顯示細菌的結(jié)構(gòu)與染色特性，對鑒別細菌意義不大。②復染法：用兩種以上的染料先后進行染色，可將不同的細菌染成不同的顏色，既能觀察細菌的大小、形態(tài)與排列，又能鑒別不同細菌的染色特性，對鑒別細菌的種類有重要意義。常用的革蘭氏染色步驟如下：①將結(jié)晶紫染液滴加在已固定的細菌涂片上，染1min后水洗；②滴加盧戈氏碘液，1min后水洗；③滴加乙醇，搖動玻片至無明顯紫色脫落為止，水洗；④滴加復染液(如沙黃染液)復染30s～1min，水洗，自然干燥或用濾紙吸干后鏡檢。革蘭氏陽性(G+)菌染成紫色；革蘭氏陰性(G-)菌染成紅色。4.細菌生長繁殖的條件細菌和其他生物一樣，必須不斷地從外界環(huán)境吸收營養(yǎng)物質(zhì)，用以合成自身的細胞成分和獲得能量，同時排泄廢物，進行新陳代謝，以維持自身的生長和繁殖。細菌生長繁殖的條件有：①充足的營養(yǎng)：細菌生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)有水、無機鹽、碳源、氮源和生長因子。生長因子是許多細菌生長過程中必需、但不能自身合成的因子，如某些特殊氨基酸、維生素、嘌呤和嘧啶等。②適宜的酸堿度：不同種類的細菌，生長時的最適酸堿度有差異。多數(shù)病原菌的最適pH7.2～7.6。但有些細菌，如霍亂弧菌在pH8.4～9.2生長良好；乳酸桿菌的最適pH為5.0左右。③適宜的溫度：不同種類的細菌，對溫度的適應(yīng)性不同，一般在15℃～40℃條件下均能生長。大多數(shù)病原菌生長的最適溫度為37℃。④必要的氣體環(huán)境：細菌生長繁殖所需的氣體主要是氧氣和二氧化碳。按對氧氣的要求不同，可將細菌分為三類：①只能在有氧條件下生長的細菌稱為專性需氧菌，如霍亂弧菌；②只能在無氧環(huán)境下才能生長的細菌稱為專性厭氧菌，如破傷風桿菌；③在有氧和無氧條件下均能生長的細菌稱為兼性厭氧菌，多數(shù)病原菌屬此類型，如葡萄球菌。一、細菌5.細菌的代謝產(chǎn)物細菌在代謝過程中產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，其中有些產(chǎn)物可供鑒別細菌用，有些與細菌的致病性有關(guān)，有些可用于防治疾病。(1)合成代謝產(chǎn)物①毒素及侵襲性酶：細菌能產(chǎn)生對機體有害的毒素。內(nèi)毒素由G-菌產(chǎn)生；外毒素大多由G+菌產(chǎn)生，但少數(shù)G-菌也能產(chǎn)生外毒素。某些細菌還能產(chǎn)生具有侵襲性的酶，損傷機體組織，如金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的血漿凝固酶等。②熱原質(zhì)：許多G-桿菌及少數(shù)G+桿菌，能產(chǎn)生一種耐熱物質(zhì)，注入人或動物體內(nèi)可致發(fā)熱反應(yīng)，故稱熱原質(zhì)。它耐高溫，一般的高壓蒸氣滅菌法不易使之破壞。可用蒸餾、吸附、濾過等方法除去液體中大部分熱原質(zhì)。生物制品、靜脈滴注用注射劑應(yīng)不含有熱原質(zhì)。③色素：許多細菌在一定條件下能產(chǎn)生各種色素，如金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的金黃色脂溶性色素和銅綠假單胞菌產(chǎn)生的綠色水溶性色素等，這些特征有助于鑒別細菌。④抗生素：是指某些微生物在代謝過程中產(chǎn)生的，能選擇性抑制和殺死它種生物細胞的代謝產(chǎn)物?？股刂饕煞啪€菌和真菌產(chǎn)生。⑤細菌素：某些細菌能產(chǎn)生一類具有抗菌作用的蛋白質(zhì)，其抗菌范圍狹窄，僅對近緣細菌有抗菌作用。主要用于細菌的分型和流行病學調(diào)查。⑥維生素：人體腸道內(nèi)的某些細菌如大腸桿菌，能合成維生素B和維生素K，可供人體利用。一、細菌(2)分解代謝產(chǎn)物：各種細菌具有不同的酶，對物質(zhì)的分解利用能力和代謝產(chǎn)物有所不同。利用這些生化特性來鑒別細菌，統(tǒng)稱為細菌的生化反應(yīng)。①糖代謝產(chǎn)物：糖的分解產(chǎn)物主要是酸類(甲酸、醋酸和乳酸)、醇類(乙醇、丁醇、乙酰甲基甲醇等)、酮類和氣體(二氧化碳、氫氣)等。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖，產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；而傷寒桿菌則不能分解乳糖，分解葡萄糖只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，據(jù)此可用于細菌的鑒別。②蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物：不同細菌對蛋白質(zhì)和氨基酸的分解能力不同，如大腸桿菌能分解色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)；沙門氏菌能分解胱氨酸等含硫氨基酸產(chǎn)生硫化氫氣體，據(jù)此可幫助鑒別細菌。一、細菌④鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某些特定成分(如糖、醇類的指示劑等)，用于觀察細菌的各種生化反應(yīng)。⑤厭氧培養(yǎng)基：專性厭氧菌須在無氧條件下才生長，因此需制備與氧隔絕或在細菌生長時達到無氧環(huán)境的培養(yǎng)基，如皰肉培養(yǎng)基。(2)常用培養(yǎng)基的制備程序：制備一般培養(yǎng)基的主要程序可分為配料、溶化、調(diào)整pH值、澄清過濾、分裝、滅菌、檢定、保存等步驟。(3)細菌的接種方法：接種細菌采用接種針(環(huán))來沾取細菌標本，進行接種。接種環(huán)與接種針以白金絲最為理想，也可用鎳鉻絲代替，二者均能耐高溫且傳熱快，經(jīng)火焰滅菌后冷卻快。一、細菌①平板曲線劃線法：先將標本涂于平板表面的一角，然后用接種環(huán)自此開始，向左右兩側(cè)劃線并逐漸向下移動，連續(xù)劃成若干條分散的平行線。②斜面接種法：主要用于鑒定或保存菌種。以左手持培養(yǎng)基，右手持接種環(huán)(針)，通過火焰滅菌后冷卻挑取菌落；左手立即換取斜面培養(yǎng)基管，以右手小指和無名指拔取棉塞，夾持于手指間。立即將管口通過火焰滅菌后將接種環(huán)伸入斜面管內(nèi)，先從斜面底部到頂端拖一條接種線，再自下而上劃曲線接種。③傾注平板法：常用于液體標本的細菌計數(shù)。取原標本或經(jīng)適當稀釋的標本1ml，置于直徑9cm無菌平皿內(nèi)，傾注已熔化并冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基約13～15ml，立即混勻，待凝固后倒置，于37℃培養(yǎng)18～24h，作菌落計數(shù)。④穿刺接種法：多用于觀察細菌動力及某些生化反應(yīng)。方法與斜面接種類似。以接種針挑取菌落少許，插入半固體培養(yǎng)基的中央，穿刺至培養(yǎng)基底部，然后沿原穿刺線退出接種針。⑤液體接種法：以接種環(huán)挑取菌落，在試管內(nèi)壁與液面交界處輕輕研磨，使細菌混勻在液體培養(yǎng)基中。一、細菌(4)細菌的培養(yǎng)方法：細菌的培養(yǎng)方法有以下三種：①一般培養(yǎng)法：又稱需氧培養(yǎng)法，在30℃～37℃溫箱中培養(yǎng)普通需氧或兼性厭氧菌。②二氧化碳培養(yǎng)法：將某些在有二氧化碳環(huán)境下才能生長的細菌(如腦膜炎球菌)，放在二氧化碳環(huán)境中進行培養(yǎng)的方法。③厭氧培養(yǎng)法：厭氧菌由于對氧敏感，在其分離及鑒定過程中均需在無氧的環(huán)境下培養(yǎng)，否則就不能生長甚至死亡。(5)細菌在培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：將細菌接種到培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24h，即可出現(xiàn)肉眼可見的生長現(xiàn)象。在液體培養(yǎng)基中，可出現(xiàn)均勻混濁、沉淀及形成菌膜等。若將細菌接種于固體培養(yǎng)基的表面，經(jīng)培養(yǎng)后，可形成單一的肉眼可見的細菌集團，稱為菌落。菌落的大小、形狀、色澤等因細菌種類的不同而異，有助于細菌的鑒別(見圖3-10)。當細菌在固體培養(yǎng)基表面密集生長時，多個菌落融合在一起，稱為菌苔。細菌在半固體培養(yǎng)基中生長時，無鞭毛的細菌，沿穿刺線生長；有鞭毛的細菌則沿穿刺線向周圍擴散呈云霧狀混濁生長，借此可判斷細菌有無動力。圖3-10細菌的菌落形態(tài)二、真菌1.酵母型菌落類似一般細菌菌落，菌落光滑、濕潤、柔軟、致密，顯微鏡檢查可見圓形或橢圓形芽生細胞，酵母菌及隱球菌多為此種菌落。2.酵母樣菌落外觀性狀同酵母型菌落。但在菌落表面除有芽生細胞外，還有假菌絲伸入培養(yǎng)基中，如白色念珠菌。3.絲狀菌落菌落疏松，呈棉絮狀、絨毛狀或粉末狀，菌落正面和背面可顯示各種不同的顏色，如白色、黃色、紅色、紫色或灰色等，常作為鑒定菌種的參考。毛霉菌和皮膚絲狀菌等多細胞真菌產(chǎn)生此型菌落。霉菌、酵母菌與細菌在營養(yǎng)瓊脂及玫瑰紅鈉瓊脂平板上的菌落形態(tài)區(qū)別，見表3－6。二、真菌一、染菌限度檢驗原則染菌限度檢驗是以規(guī)定的方法與步驟，測定藥品中染菌的程度。必須遵循下述基本準則：1.供試品抽樣、保存及檢驗量供試品一般按批號隨機抽樣。每批取檢驗用量的3倍量。每批抽樣應(yīng)至少含有2個以上最小包裝單位。抽樣時，凡發(fā)現(xiàn)有異常的樣品，應(yīng)先抽取有疑問的樣品；但機械損傷、明顯破裂的包裝，不能抽作樣品。肉眼可見長螨、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品，無需再抽樣檢查，可直接判為不合格品。供試品在檢驗前不得任意開啟，以防再污染。所需樣品必須保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防引起原染菌狀況發(fā)生變化。各種藥品檢驗取樣量都有明確規(guī)定。所有劑型的檢驗量必須取自2個以上的包裝單位，大蜜丸、膜劑應(yīng)取4丸(片)以上樣品；固體和半固體制劑檢驗量為10g；液體制劑檢驗量為10ml；中藥膜劑檢驗量為30～50cm2。貴重的或微量包裝的供試品檢驗量可酌減，但口服用藥不得低于3g，外用藥不得低于5g，液體制劑采用原液直接測定者不得低于6ml，采用供試液稀釋者，不得低于3ml。一、染菌限度檢驗原則2.檢驗條件(1)培養(yǎng)溫度：除另有規(guī)定外，細菌培養(yǎng)溫度為30℃～37℃，霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為25℃～28℃，控制菌培養(yǎng)溫度為36℃±1℃。取供試液檢驗時，應(yīng)注意搖勻，以便均勻取液。檢品制成供試液后應(yīng)在1～2h內(nèi)進行檢驗。(2)陰性對照：在藥品衛(wèi)生檢查之前應(yīng)先做陰性對照試驗，以確定無菌技術(shù)的可靠性。方法是：取供試液用的稀釋劑，分別按照細菌數(shù)、霉菌數(shù)及各控制菌檢驗方法培養(yǎng)，均無菌生長，說明無菌技術(shù)可靠；否則，說明無菌技術(shù)不過關(guān)，應(yīng)查明原因。(3)陽性對照：在規(guī)定控制菌檢查中，應(yīng)做陽性對照試驗，目的是檢查供試品對控制菌生長有無干擾，培養(yǎng)條件是否適宜。方法是：將供試液分為兩組，一組中加入一定數(shù)量標準對照菌株，另一組不加對照菌株，兩組平行培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)結(jié)果。如果已知陽性菌未檢出，供試品的陰性結(jié)果應(yīng)認為無效，而陽性結(jié)果需做具體分析或?qū)嶒炘僮鹘Y(jié)論。一、染菌限度檢驗原則國家規(guī)定的各種控制菌的標準菌株是：大腸桿菌[CMCC(B)44102]、沙門氏菌[CMCC(B)50094]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]及金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]。對照用菌液的制備方法是：取相應(yīng)菌株的新鮮培養(yǎng)物1取菌環(huán)，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)18～20h后，稀釋至1:106。對照菌的加入量為50～100個。一、染菌限度檢驗原則(3)含抑菌成分的中藥制劑：供試品如干擾控制菌檢驗，按以下方法處理后，依法檢查。①稀釋法：將供試液接種入較多的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。②離心沉淀集菌法：取規(guī)定量的供試液高速(3000r/min)離心沉淀30min，棄去上清液，留底部集菌液約2ml，再稀釋成原規(guī)定量的供試液。如有不溶性藥渣，可先低速(500r/min)離心沉淀5min，取全部上清液，再行集菌處理。③薄膜過濾法：取規(guī)定量的供試液，置稀釋劑100ml中，搖勻，以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大于0.45μm±0.02μm微孔濾膜的過濾器內(nèi)，減壓抽干后，用稀釋劑沖洗濾膜三次，每次50～100ml，取出濾膜備檢。一、染菌限度檢驗原則④中和法：凡含有硫胺、汞、砷類或防腐劑的中藥制劑，可用相應(yīng)的試劑中和毒性后制成供試液。4.檢驗報告單位(1)細菌、霉菌、酵母菌數(shù)：個(菌落數(shù))/g(ml)。(2)膜劑：個/cm2或“未檢出”。(3)控制菌：以1g、1ml或10cm2為單位，報告“檢出”或“未檢出”。二、常用稀釋液、試液、指示液及培養(yǎng)基三、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)1.培養(yǎng)基與試劑營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)、0.9％無菌氯化鈉或pH7.2的無菌磷酸鹽緩沖液。2.檢驗程序供試品10g(ml)→1:10供試液（平皿2～3個）→1:102供試液（平皿2～3個）→1:103供試液營養(yǎng)肉湯（平皿2～3個）（培養(yǎng)18～24h）→30℃～35℃傾注培養(yǎng)48h±2h或25℃～28℃傾注培養(yǎng)72h±2h→菌落計數(shù)→報告。3.操作步驟(1)供試液制備：各類制劑按前述方法制備1:10供試液。(2)供試液的稀釋與注皿：用1ml無菌吸管，吸取混勻的供試液1ml，沿管壁注入裝有9ml無菌稀釋劑的試管內(nèi)，混成1:100的稀釋液。按同法依次10倍遞增稀釋成1:1000、1:10000的稀釋液備用。每一次稀釋更換一支1ml吸管。根據(jù)對供試品污染程度的估計，選擇2～3個適宜稀釋度，用一支1ml無菌吸管，按高倍稀釋至低倍稀釋的順序分別取各稀釋度的液體1ml，注入平皿內(nèi)。每個稀釋度應(yīng)作2～3個平皿。三、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)(3)傾注培養(yǎng)基：將預先配制好的培養(yǎng)基(細菌計數(shù)用營養(yǎng)瓊脂，霉菌、酵母菌計數(shù)一般用玫瑰紅鈉瓊脂，含蜂蜜、蜂王漿液體制劑另加用YPD瓊脂)熔化，冷卻至45℃時，傾注上述各平皿約15ml，旋搖平皿使混合均勻。置水平臺上待冷凝固。(4)培養(yǎng)：細菌計數(shù)平板倒置于30℃～37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h；霉菌、酵母菌計數(shù)平板于25℃～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。三、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)(3)若有3個稀釋級的平均菌落數(shù)均在30～300之間時，采用后2個稀釋級計算級間比值報告(見表4-2例4及例5)。(4)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)該按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告(見表4-2例6)。(5)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300間，以最接近30或300的稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告(見表4-2例7)。(6)若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均少于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。但若用原液為供試液，當1:10稀釋級平均菌落數(shù)等于或大于原液時，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法測定，按測定結(jié)果報告(見表4-2例8及例9)。培養(yǎng)基稀釋法：吸取供試液(原液或1:10供試液)1ml，注入5個平皿內(nèi)(每皿各0.2ml)共作3份，共15個平皿。每皿注熔化并冷至45℃左右的瓊脂培養(yǎng)基約三、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)15ml，混勻，冷凝后按規(guī)定培養(yǎng)溫度與時限培養(yǎng)，計數(shù)。每1ml注入的5個平板的菌落數(shù)之和，即為1ml的菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)，取其平均值乘以稀釋倍數(shù)報告。(7)若各稀釋級的平板均無菌落生長或測定數(shù)在10個以下時，報告菌數(shù)為＜10個/g(ml)霉菌(酵母菌)總數(shù)報告原則與細菌總數(shù)報告原則基本相同。如供試品原液平板均未生長霉菌及酵母菌，報告每毫升未檢出霉菌及酵母菌。6.菌落數(shù)的報告(1)菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按實有數(shù)據(jù)報告。(2)菌落數(shù)大于100時，采用兩位有效數(shù)字報告，第三位按數(shù)字修約規(guī)則處理。為簡便計算，也可用10的指數(shù)報告。三、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)7.復試供試品細菌數(shù)、霉菌及酵母菌數(shù)中任何一項一次檢驗不合格，應(yīng)重新取2倍包裝量供試品，依法作單項復試兩份，以三次檢驗結(jié)果的均值報告。8.注意事項一般情況下，以營養(yǎng)瓊脂平板計數(shù)細菌數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂平板計數(shù)霉菌、酵母菌數(shù)。但如果營養(yǎng)瓊脂平板生長了霉菌、酵母菌，且多于玫瑰紅鈉瓊脂平板的霉菌和酵母菌菌落數(shù)，則以營養(yǎng)瓊脂平板的霉菌、酵母菌數(shù)報告；反之，如果玫瑰紅鈉瓊脂平板生長了細菌，且多于營養(yǎng)瓊脂平板的細菌菌落數(shù)，則以玫瑰紅鈉瓊脂平板的細菌數(shù)報告。三、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)9.檢驗結(jié)論按下列方式書寫檢驗結(jié)論:本品按《中國藥典》2000年版微生物限度檢查法標準檢驗，結(jié)果符合（或不符合）規(guī)定。（三）大腸桿菌檢查法大腸桿菌為腸桿菌科埃希氏菌屬細菌，主要寄生于人和動物的腸道內(nèi)，隨糞便排出體外。藥品中檢出大腸桿菌，證明已被糞便污染，即可能污染腸道病原體。因此，大腸桿菌被列為糞便污染指示菌，是口服藥品的控制菌之一。1.培養(yǎng)基與試劑普通肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）、乳糖發(fā)酵管或5%乳糖發(fā)酵管、蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂（EMB）、麥康凱培養(yǎng)基(MacC)、三糖鐵瓊脂（TSI）、歐-波氏試劑、甲基紅指示劑、V-P試劑、革蘭氏染色液。三、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)2.檢驗程序供試品→供試液→BL增菌液（培養(yǎng)18～24h）→EMB或MacC平板（培養(yǎng)18～24h）→無菌落生長，報告；有疑似菌落→TSI（培養(yǎng)18～24h）→革蘭氏染色鏡檢；或乳糖發(fā)酵；或IMViC試驗→報告。3.操作步驟(1)增菌培養(yǎng)：取均勻供試液10ml，加入備妥的100mlBL增菌液內(nèi)，培養(yǎng)18～24h。(2)分離培養(yǎng)：將上述增菌液搖勻，再用接種環(huán)沾取1～2環(huán)在EMB或MacC平板上劃線接種，培養(yǎng)18～24h，觀察菌落生長情況。大腸桿菌在EMB瓊脂平板上的典型菌落呈紫黑色或中心紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤，常有金屬光澤；在MacC平板上的典型菌落呈桃紅色或中心桃紅，圓形扁平，光滑濕潤。但從藥品中分離的菌株，常出現(xiàn)非典型的菌落，在EMB平板上呈淺紫色或粉紅色，無明顯暗紅色中心，無金屬光澤；在MacC平板上呈微紫色或粉色。因此，以上形態(tài)均應(yīng)作為疑似菌落進行鑒定，切勿漏檢。分離平板上無菌落生長或無疑似菌落生長，可做出未檢出報告。(3)純培養(yǎng)：用接種針從疑似菌落中心沾出少許，接種于三糖鐵瓊脂斜面上，培養(yǎng)18～24h，供各鑒別試驗用。(4)革蘭氏染色：取上述疑似大腸桿菌的純培養(yǎng)物涂片，作革蘭氏染色鏡檢。大腸桿菌為G‐無芽胞短桿菌。三、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)(5)生化反應(yīng)①乳糖發(fā)酵試驗：取上述斜面培養(yǎng)物接種于乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)24～48h，取出觀察結(jié)果。大腸桿菌應(yīng)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。產(chǎn)酸者，以酸性復紅為指示劑的培養(yǎng)基顯紅色；以溴甲酚紫為指示劑的培養(yǎng)基顯黃色。產(chǎn)氣者，倒管內(nèi)有氣泡。為避免遲緩發(fā)酵乳糖造成假陰性，可選用5％乳糖發(fā)酵管。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細菌可于24h出現(xiàn)陽性。三、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)②IMViC試驗：①靛基質(zhì)試驗(I)：取斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48h，沿管壁加入歐-波氏試劑數(shù)滴，輕微搖動試管，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。②甲基紅試驗(M)：取斜面培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h。每1ml培養(yǎng)物中加入甲基紅試劑1滴搖勻，立即觀察結(jié)果，呈鮮紅色或桔紅色為陽性，呈黃色為陰性。③V-P試驗(Vi)：取斜面培養(yǎng)物接種于磷酸鹽葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48h，每2ml培養(yǎng)液中加入V-P試劑甲液(6％α-萘酚乙醇溶液)1ml，混勻，再加V-P試劑乙液(40％KOH)0.4ml，充分振搖，如在4h內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性，無紅色為陰性。④枸櫞酸鹽利用試驗(C)：取斜面培養(yǎng)物，接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。斜面有菌苔生長，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{色時為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變，無菌苔生長為陰性。大腸桿菌IMViC反應(yīng)模式為++--或-+--。4.結(jié)果報告：完全符合以下結(jié)果時，判定為檢出大腸桿菌：染色鏡檢是G-無芽胞桿菌；發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；IMViC試驗反應(yīng)為++--或-+--。四、控制菌檢查五、微生物限度標準第三節(jié)活螨檢查法一、活螨的檢查二、活螨卵的檢查一、活螨的檢查螨屬于節(jié)肢動物門蛛形綱蜱螨目，其種類多，分布廣，在土壤、水、動植物、食品和藥品中均可發(fā)現(xiàn)。藥品可因其原料、生產(chǎn)過程、包裝、運輸、貯存等條件不良，受到螨的污染。藥品染螨后，可在短期內(nèi)發(fā)霉變質(zhì)失效，一些螨類還可直接引起皮炎、肺螨、腸螨等疾病,傳播疾病或危害人體健康。藥典規(guī)定，藥品特別是中成藥，不得檢出活螨。（一）螨的形態(tài)特征螨的體形小，多在1mm以下，肉眼可察見，但需用放大鏡或顯微鏡才能觀察鑒別。螨的形狀一般呈卵圓形或橢圓形，無頭、胸、腹界限。幼蟲足三對，成螨足多數(shù)為四對。足通常有六節(jié)組成?？谄飨蚯岸送怀?，螯肢常呈螯鉗狀，有齒，由2～3節(jié)組成。須肢節(jié)數(shù)因種類而異，由1～5節(jié)組成。有些種類在軀體前端或兩側(cè)有1～2對眼。軀體兩側(cè)對稱，表面被有堅硬的幾丁質(zhì)的板。體表有剛毛。螨的形態(tài)因種類而異（見圖）。螨類與蜘蛛、昆蟲（如書虱），外形比較近似，應(yīng)注意區(qū)別（見表4-1）。圖中藥材中常見的螨一、活螨的檢查一、活螨的檢查（二）活螨的檢查1.活螨的一般檢查方法（1）漂浮法：將供試品放入盛有適量飽和鹽水的漂浮瓶中，攪拌均勻。再緩慢加入飽和鹽水，至液面略高于瓶口（為防止水溢出，可將漂浮瓶放在培養(yǎng)皿內(nèi)），上覆以潔凈的載玻片，使玻片與液面接觸沾取液面上的漂浮物，將載玻片迅速翻轉(zhuǎn)，置顯微鏡下觀察。一、活螨的檢查（2）直檢法：取供試品先用肉眼觀察，若有疑似活螨的白點或其他顏色的點狀物，可用5～10倍放大鏡或?qū)嶓w顯微鏡檢查。有螨者，用解剖針或發(fā)絲針或小毛筆挑取活螨放在滴有一滴稀甘油的載玻片上，置顯微鏡下觀察。（3）分離法：也稱烤螨法，將供試品置于附有適宜孔徑篩網(wǎng)的玻璃漏斗內(nèi)，利用活螨避光、怕熱的習性，在漏斗的廣口上面放一個60～100W的燈泡，距離藥品6cm處，照射1～2h?；铗裳芈┒返撞考氼i內(nèi)壁向下爬，用小燒杯裝半杯稀甘油，放在漏斗的下口處，收集爬出的活螨。發(fā)絲針的制作：取長約10cm的小金屬棒一根和長約1.5cm的頭發(fā)絲一根，以頭發(fā)絲長度的一半緊貼在金屬棒的尖端上，用細線將其纏緊，然后粘上加拿大樹脂或油漆晾干，即得。一、活螨的檢查2.各型中藥制劑活螨的檢查各劑型供試品，每批應(yīng)抽取2瓶或2盒以上的包裝單位；貴重或微量包裝的供試品，取樣量可酌減。必要時，可再次抽樣，或選取有疑問的樣品進行檢查。（1）大蜜丸：將藥丸外殼（蠟殼或紙蠟殼）置酒精燈小火焰上，轉(zhuǎn)動，適當燒灼（殺滅外殼可能污染的活螨）后，小心打開。①表面完好的藥丸，用消毒的解剖針刺入藥丸，手持解剖針，在放大鏡或?qū)嶓w顯微鏡下檢查。同時注意檢查丸殼的內(nèi)壁或包丸的油紙有無活螨。②有蟲粉的藥丸，可用放大鏡或?qū)嶓w顯微鏡直接檢查，也可用漂浮法檢查。（2）小蜜丸、水丸：①表面完好的藥丸，可將供試品放在預先襯有潔凈黑紙的培養(yǎng)皿或小搪瓷盤中，用直檢法檢查。如未能檢出活螨時，可再用漂浮法或烤螨法檢查；②有蟲粉的藥丸，可用直檢法或漂浮法檢查，同時注意檢查藥瓶內(nèi)壁及內(nèi)蓋有無活螨。一、活螨的檢查（3）散劑、顆粒劑和膠囊劑：先直接檢查藥品內(nèi)蓋及塑料薄膜袋的內(nèi)側(cè)有無活螨。后將藥品放在襯有潔凈黑紙的培養(yǎng)皿或搪瓷盤中，使成薄層，直接檢查。必要時可再用漂浮法檢查。并注意檢查藥瓶口及內(nèi)壁是否有螨。（4）塊狀沖劑：直接檢查供試品的包裝蠟紙、玻璃紙或塑料薄膜的內(nèi)側(cè)有無活螨。有蟲粉者，用直檢法配合漂浮法檢查。（5）液體制劑及半固體膏劑：先用75%乙醇將藥瓶的外蓋螺口周圍消毒后小心旋開外蓋，用直檢法，檢查藥瓶外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口內(nèi)外的周圍與內(nèi)蓋有無活螨。必要時配合漂浮法和烤螨法檢查。二、活螨卵的檢查螨卵極小，一般在0.1mm以下，乳白色，卵圓形。顯微鏡下才能察見。對可疑供試品，未檢出活螨時，應(yīng)注意檢查活螨卵?？刹捎脵z查活螨的直檢法或漂浮法檢查。如發(fā)現(xiàn)可疑螨卵時，小心挑取，放入中央滴有2滴稀甘油的載玻片上，置顯微鏡下檢查。為確證挑取物是否為活螨卵，可將上述載玻片置培養(yǎng)皿中，加蓋。25℃～30℃培養(yǎng)10d，每天上、下午定時用顯微鏡檢查，如在稀甘油中孵出幼螨，則判斷為檢出活螨卵。（四）檢驗報告供試品按上述規(guī)定檢查，檢出活螨，應(yīng)作檢出活螨報告；未檢出活螨，但檢出活螨卵，也按檢出活螨處理。為保留陽性結(jié)果備查，可將檢出的螨按下法處理保存：將活螨放在預先滴有1滴75%乳酸液的載玻片上，蓋上蓋玻片，在酒精燈小火焰上來回移動，緩緩加熱片刻，使其適當透化，即可鏡檢。鑒定后的螨體，可放入70%的乙醇中保存，或作固定處理。第四節(jié)熱原檢查法

一、供試用家兔二、試驗前的準備三、檢查方法四、結(jié)果判斷一、供試用家兔二、試驗前的準備三、檢查方法按規(guī)定作好實驗前的準備。檢查時，取適用的家兔3只，測定其正常體溫后15min內(nèi)，自耳靜脈緩緩注入規(guī)定劑量并溫熱至約38℃的供試品溶液，然后每隔30min測量其體溫1次，共測6次，以6次中最高的一次體溫減去正常體溫，即為該家兔體溫的升高。如3只家兔中有一只體溫升高0.6℃或0.6℃以上，或3只家兔體溫升高均低于0.6℃，但體溫升高的總和達1.4℃或1.4℃以上，應(yīng)另取5只家兔復試。如果初試的3只家兔體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔體溫升高的總和低于1.4℃，或在復試中，體溫升高為0.6℃或0.6℃以上的家兔僅有1只，并且初、復試的8只家兔體溫升高總和為3.5℃或3.5℃以下，均認為供試品的熱原檢查合格，否則為不合格。四、結(jié)果判斷第五節(jié)無菌檢查法一、直接接種法二、薄膜濾過法一、直接接種法直接接種法適用于非抗菌作用的供試品。檢查時按中國藥典規(guī)定的最低檢驗量取樣后，分別接種于需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基6管，其中1管接種金色葡萄球菌對照用菌液lml，作為陽性對照，另接種于真菌培養(yǎng)基5管。輕輕搖動，使供試品與培養(yǎng)基混合。需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基管置30℃～35℃，真菌培養(yǎng)基管置20℃～25℃，培養(yǎng)7日。陽性對照管在24h內(nèi)應(yīng)有菌生長，需氣菌、厭氣菌和真菌培養(yǎng)基管均為澄清或雖顯混濁但經(jīng)證明并非有菌生長，則判斷為供試品合格。如培養(yǎng)基中有1管顯混濁并確證有菌生長，應(yīng)重新取2倍供試品，依法復試，除陽性對照管外，其他各管均不得有菌生長，否則應(yīng)判為供試品不合格。二、薄膜濾過法如供試品有抗菌作用，用薄膜過濾法檢查。檢查時取規(guī)定量的供試品，加入0.9％無菌氯化鈉溶液或其它適宜的溶劑至少l00ml中，混合后，通過裝有孔徑不大于0.45μm的薄膜過濾器，再用0.9％無菌氯化鈉溶液或其它溶劑沖洗濾膜至陽性對照菌正常生長，將需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)基以及陽性對照分別加至薄膜過濾器內(nèi)，或取出濾膜分成3等份，分別加入上述培養(yǎng)基中，陽性對照管應(yīng)加入相應(yīng)的對照菌液lml。按規(guī)定時間培養(yǎng)，判斷的方法同直接接種法。即陽性對照管在24h～48h內(nèi)應(yīng)有菌