第三章DNA測序技術(shù)

第三章DNA測序技術(shù)第一頁，共四十頁，2022年，8月28日20世紀(jì)人類科技發(fā)展史上的三大創(chuàng)舉

90年代人類基因組計(jì)劃40年代曼哈頓原子彈計(jì)劃60年代阿波羅登月計(jì)劃第二頁，共四十頁，2022年，8月28日人類基因組計(jì)劃

人類基因組計(jì)劃（Humangenomeproject）于1990年啟動，我國于1999年加入該計(jì)劃，承擔(dān)其中1%的任務(wù)，即人類3號染色體短臂上約30Mb的測序任務(wù)。美國擔(dān)了54%，其次是英國，承擔(dān)了33%，日本為7%，法國為2.8%，德國為2.2%。

第三頁，共四十頁，2022年，8月28日二000年六月二十六日克林頓宣布人類基因組草圖繪制完成第四頁，共四十頁，2022年，8月28日2000年6月公共領(lǐng)域測序計(jì)劃工作框架圖第五頁，共四十頁，2022年，8月28日2002.112004.12水稻和雞基因組第六頁，共四十頁，2022年，8月28日華大基因于2007年10月完成了第一個中國人的高質(zhì)量基因組圖譜——“炎黃一號”2008年1月12日由中國、英國和美國的科學(xué)家在深圳、倫敦和華盛頓同時宣布國際“千人基因組計(jì)劃”正式啟動。最終目標(biāo)是獲得歐、亞、美、非各洲不同人群中2500人的基因數(shù)據(jù)。

人基因組第七頁，共四十頁，2022年，8月28日大熊貓基因組-2010.1“大熊貓基因組”項(xiàng)目于2008年3月啟動。研究表明，大熊貓有21對染色體，基因2萬多個。第八頁，共四十頁，2022年，8月28日

破解古人類基因組-2010.2

“薩卡克(Saqqaq)”的人類群體，約在4750年前至2500年前居住于格陵蘭島，其后滅絕。Saqqaq古人的遺傳信息比公認(rèn)的美洲原住民(主要是印第安人和因紐特人，同屬黃種人)更加接近于現(xiàn)代東亞和西伯利亞人群。第九頁，共四十頁，2022年，8月28日人體腸道菌群元基因組-2010.3

收集了124個來自于歐洲人腸道菌群的樣本,這個基因集中包含了絕大部分目前已知的人體腸道微生物基因,但更多的是目前未知微生物的基因。從這個基因集中可以估計(jì)人腸道中存在約1000到1150種細(xì)菌,平均每個體內(nèi)約含有160種優(yōu)勢菌種,并且這些細(xì)菌是絕大部分個體所共有的。

第十頁，共四十頁，2022年，8月28日2009年4月啟動了“世界三極動物基因組計(jì)劃”2009年8月啟動了“萬種微生物基因組計(jì)劃”。2010年1月啟動了“1000種動植物基因組計(jì)劃”，計(jì)劃未來兩年內(nèi)為一千種重要動植物進(jìn)行測序，并從科學(xué)界征集測序物種的提案。

第十一頁，共四十頁，2022年，8月28日（一）化學(xué)裂解法

(Maxam＆Gilbert,1977)（二）雙脫氧鏈末端終止法

(Sanger,1977)（三）DNA自動化序列分析解讀生命的天書-DNA測序第十二頁，共四十頁，2022年，8月28日

DNA測序技術(shù)基礎(chǔ)：

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高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）技術(shù)

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PAGE能分離長度為300-500個堿基,差別僅1個堿基的單鏈寡核苷酸DNA片段。

第十三頁，共四十頁，2022年，8月28日核酸序列分析的基本原理化學(xué)降解法(Maxam-Gillbert法)DNA鏈的末端合成終止法(sanger法)第十四頁，共四十頁，2022年，8月28日一、化學(xué)降解法測序的原理1、用放射性核素標(biāo)記待測DNA一側(cè)末端2、將標(biāo)記DNA分為G、A+G、C+T、C4個反應(yīng)體系3、用不同的化學(xué)試劑處理不同反應(yīng)體系，隨機(jī)斷裂DNA片段某種堿基中的任何一個，產(chǎn)生一組一端為放射線標(biāo)記的末端，另一端為不同大小的DNA片段的混合物4、電泳分離，放射自顯影得到互相錯落的梯形圖譜，即可讀出DNA序列第十五頁，共四十頁，2022年，8月28日堿基特異性修飾及裂解反應(yīng)體系堿基修飾試劑堿基修飾反應(yīng)主鏈斷裂試劑斷裂點(diǎn)G硫酸二甲酯鳥嘌呤甲基化六氫吡啶GG+A甲酸脫嘌呤作用六氫吡啶G和AC+T肼嘧啶開環(huán)六氫吡啶C和TC肼（加鹽）胞嘧啶開環(huán)六氫吡啶C第十六頁，共四十頁，2022年，8月28日

化學(xué)降解G反應(yīng)模式圖硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet第十七頁，共四十頁，2022年，8月28日化學(xué)降解法基本步驟

(1)先將DNA的末端之一進(jìn)行標(biāo)記(通常為放射性同位素32P；(2)在多組互相獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)中分別進(jìn)行特定堿基的化學(xué)修飾；(3)在修飾堿基位置化學(xué)法斷開DNA鏈；(4)聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長短分開；(5)根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出DNA的核苷酸序列.

第十八頁，共四十頁，2022年，8月28日第十九頁，共四十頁，2022年，8月28日CT+CG+AATTGTCAGGAC試試看第二十頁，共四十頁，2022年，8月28日二、雙脫氧鏈終止法（Sanger法）原理

DNA鏈中的戊糖在3’位碳原子上有-OH基團(tuán)，在

DNA合成、鏈的延長過程中，新?lián)饺氲拿撗鹾塑账?’-p與前一核苷酸的戊糖3’-OH以磷酸二酯鍵相連。

第二十一頁，共四十頁，2022年，8月28日Sanger法是在反應(yīng)體系中加入2’,3’-ddNTP，由于其沒有3’-OH而不能與下一個核苷酸相連，于是DNA鏈的合成便終止。第二十二頁，共四十頁，2022年，8月28日在PCR時加入標(biāo)記的復(fù)制終止劑，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相應(yīng)于4種堿基）ddX的兩個作用：可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接電泳誰終止，堿基就是誰此方法獲1980年的Nobel獎Sanger法：第二十三頁，共四十頁，2022年，8月28日第二十四頁，共四十頁，2022年，8月28日第二十五頁，共四十頁，2022年，8月28日5’3’5’AGCTATCAGCGAAT雙脫氧鏈終止法DNA序列分析原理示意圖第二十六頁，共四十頁，2022年，8月28日序列識讀自下而上，5’3’所讀序列為模板的互補(bǔ)鏈第二十七頁，共四十頁，2022年，8月28日三、DNA測序自動化和大規(guī)模測序特點(diǎn):原理同sanger法標(biāo)記物為熒光染料（與雙脫氧核苷三磷酸共價相連)激光掃描自動測序結(jié)果清晰、準(zhǔn)確、分辨率高測序速度快第二十八頁，共四十頁，2022年，8月28日DNA自動測序步驟：

4種帶有不同熒光染料標(biāo)記的終止物ddNTPsSanger測序反應(yīng)反應(yīng)產(chǎn)物毛細(xì)管電泳分離激光激發(fā)、熒光信號采集、計(jì)算機(jī)分析與DNA自動排序。第二十九頁，共四十頁，2022年，8月28日第一步：加入復(fù)制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快第三十頁，共四十頁，2022年，8月28日第二步：熒光檢測第三十一頁，共四十頁，2022年，8月28日DNA自動測序與手工測序的不同點(diǎn)1、標(biāo)記物不同：手工測序采用放射性核素標(biāo)記，而自動測序采用4種熒光染料分別標(biāo)記ddNTP或標(biāo)記引物2、加樣方式不同：手工測序，一個樣品的4個測序反應(yīng)物分別在不同泳道進(jìn)行，而自動測序可在一個泳道內(nèi)電泳3、檢測手段不同：手工測序采用放射自顯影，從4種寡聚核苷酸的梯子形圖譜中讀出DNA序列，而自動測序則采用激光掃描器同步掃描，計(jì)算機(jī)進(jìn)行閱讀和編輯第三十二頁，共四十頁，2022年，8月28日第三十三頁，共四十頁，2022年，8月28日第三十四頁，共四十頁，2022年，8月28日第三十五頁，共四十頁，2022年，8月28日序列圖譜第三十六頁，共四十頁，2022年，8月28日第三十七頁，共四十頁，2022年，8月28日第三十八頁，共四十頁，2022年，8月28日全自動的測序儀器：MegaBac