抗細(xì)菌轉(zhuǎn)基因工程課程資料

水稻細(xì)條病的發(fā)現(xiàn)水稻細(xì)菌性條斑病(簡(jiǎn)稱細(xì)條病)由XanthomonascamPestrispv.Oryzicola（簡(jiǎn)稱Xoc）引起。最早在1918年由Reinking首次報(bào)道了菲律賓水稻上發(fā)生細(xì)條病,在我國(guó)范懷忠等(1957)于20世紀(jì)50年代在廣東省首先發(fā)現(xiàn)該病害。開始時(shí)誤認(rèn)為是白葉姑病，后經(jīng)方中達(dá)等(1957)將該病與白葉枯病區(qū)分開來’確認(rèn)為一種新的由細(xì)菌性病害。第一頁(yè)，共三十頁(yè)。病菌特點(diǎn)該病菌屬黃單胞桿菌屬細(xì)菌,生長(zhǎng)最適溫28-30°C。低于16°C基本不發(fā)病。細(xì)條病的發(fā)生初侵染源主要有稻種、稻草和自生稻帶菌,但也不排除野生稻、李氏禾的交叉?zhèn)魅?。病原菌主要從傷口侵?菌膿可借風(fēng)、雨、露等傳播后進(jìn)行再侵染。高溫高濕等有利于病害發(fā)生。臺(tái)風(fēng)暴雨造成傷口,病害容易流行。偏施氮肥,灌水過深加重發(fā)病。第二頁(yè)，共三十頁(yè)。水稻細(xì)條病的發(fā)病特點(diǎn)

危害水稻的主要特點(diǎn):主要侵害水稻葉片,病斑初呈暗綠色水橫狀半透明小斑點(diǎn),后逐漸沿葉脈方向擴(kuò)展,成黃褐色,干結(jié)后呈黃色樹膠狀小粒,形如虛線,不易脫落。發(fā)病嚴(yán)iR吋,條斑融合成不規(guī)則的黃褐色至枯白色大斑塊,外觀與白葉枯病有些相似,但對(duì)光觀察,病斑呈半透明狀。病害流行時(shí),葉片卷曲,完全呈一片白色。該病在水稻生長(zhǎng)前期、后期都易感染,苗期癥狀較白葉枯病明顯;病害嚴(yán)重時(shí)能引起稻株早期死亡或不能抽穂。即使能夠抽穗結(jié)實(shí),但批谷增多,千粒重降低。一般年份可減產(chǎn)10%-20%,在氣候條件沾發(fā)病嚴(yán)重時(shí)達(dá)40%。第三頁(yè)，共三十頁(yè)。Rxo1基因來源Rxo1基因是來自玉米的一個(gè)抗玉米細(xì)菌性條斑病的寄主抗性基因，將其轉(zhuǎn)入水稻后轉(zhuǎn)基因水稻中接種細(xì)菌性條斑病病原菌，在接種點(diǎn)處表現(xiàn)典型的HR表型，證實(shí)該基因?yàn)橐恢匾姆羌闹骺剐曰颉５谒捻?yè)，共三十頁(yè)。Rxo1基因定位Rxo1基因CDS序列全長(zhǎng)（從起始密碼子ATG到終止密碼子TAG）為2718bp。與許多R基因一樣，該基因編碼的產(chǎn)物是NBS-LRR結(jié)構(gòu)的抗病蛋白（GenBank登錄號(hào)為AAX31149.1），其蛋白質(zhì)序列為905aa。根據(jù)SMART數(shù)據(jù)庫(kù)軟件掃描該蛋白的domains、repeats、motifs，找到一個(gè)從4-18位點(diǎn)的lowcompositionalcomplexity：IAVLLVLKKIAIALA及一個(gè)位于118-147的coiledcoilregion（LVSLDEIASEIKKIKQELKQLSESRDRWTK）；此外還預(yù)測(cè)到了37個(gè)其余結(jié)構(gòu)（如UME_PTB、SynN、IRO、RING、NADH-G_4Fe-4、TOP1Ac、LRR_BAC、IFabd、SCAN、LytTR、LRR_CC、LRR_TYP及LRR_SD22等），但是其顯著性未達(dá)到極顯著的閾值。Sanger的分析則找到3個(gè)Pfam-Amatchs，其中顯著的一個(gè)是NB-ARC結(jié)構(gòu)：envelope范圍是183-470；比對(duì)結(jié)果的范圍則是185-467；HMM范圍為3-282；另有兩個(gè)非顯著的4個(gè)copy的LRR結(jié)構(gòu)。第五頁(yè)，共三十頁(yè)?；騌xo1的雙右邊界雙元載體的構(gòu)建1.1菌株和載體含有9kbRxo1基因的pCAMBIA1305-1Rxo1質(zhì)粒由美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)ScotH.Hulbert博士提供。pCAMBIA1305-1質(zhì)粒是由澳大利亞CAMBIA研究中心構(gòu)建的含有35S啟動(dòng)子和細(xì)菌卡那霉素抗性基因的雙元載體。采用的農(nóng)桿菌菌株為EHA105。第六頁(yè)，共三十頁(yè)。

（1）美國(guó)Kansas州立大學(xué)的ScotH.Hulbert博士提供pCA1ViBIA1305-1質(zhì)粒，其中

攜帶有外源目的基因Rxol;

pCAMBIA1305-1質(zhì)粒第七頁(yè)，共三十頁(yè)。

（2）澳大利亞CSIROPlantIndustry的MUpadhyaha博士提供雙右邊界雙元載體pMNDRBBin6。該載體用于轉(zhuǎn)接Rxol基因并將重組體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)基因:雙右邊界雙元載體pMNDRBBin6結(jié)構(gòu)圖及可能產(chǎn)生的3種TDNA類型(3)農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404;(4)大腸桿菌菌株為DHSa;第八頁(yè)，共三十頁(yè)。1.2雙右邊界雙元載體的構(gòu)建1.感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化2.雙右邊界雙元載體構(gòu)建（1）目的基因和載體的酶切連接將攜帶Rxol基因的載體pCAMBIA1305-1用限制性內(nèi)切酶SacI(AGTVACT),NgoMN(GVCCGGC)進(jìn)行消化，同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶XmaI(CVCCGGG)和HpaI(GTTVAAC)消化載體pMNDRBBin6。將酶切后得到的目的基因片斷和雙元載體用T4噬菌體連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。第九頁(yè)，共三十頁(yè)。質(zhì)粒pCAMBIA1305-1-Rxol經(jīng)內(nèi)切酶SacI和NgoMIV酶切，得到大小為8.Skb的Rxol目的基因片斷(圖A)，載體pMNDRBBin6經(jīng)HpaI和XmaI酶切，得到大小為12.3kb的線性化雙右邊界載體(圖B)

A:SacI和NgoMN酶切pCAMBIAI305-I-Rxol;B:HpaI和XmaI酶切pMNDRBBin6;I:pCAMBIA1305-1-Rxol;2:pMNDRBBin6;M:250byDNAMarker.第十頁(yè)，共三十頁(yè)。(2)陽(yáng)性克隆篩選將過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在LB固體培養(yǎng)基(含SOmg/L壯觀霉素)上涂布37℃培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子單克隆于LB培養(yǎng)基(含SOmg幾壯觀霉素)中振蕩培養(yǎng)Sh;提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，使用引物Rxol-F(5‘ACTCGGTAAACCTACGGACTGA-3’)和Rxol-R(5‘-CTTCCTGCAGGTATACCACTCC-3’)篩選獲得陽(yáng)性克隆;篩選出1個(gè)轉(zhuǎn)化子，其特異性擴(kuò)增片段與1.45kb目的基因片段Rxol大小相符。提取該克隆質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小與陽(yáng)性對(duì)照pCAMBIA1305-1-Rxol相同，將產(chǎn)物回收純化連接到pMD20-T上測(cè)序，與目的基因序列比對(duì)相同，表明Rxol基因片段已整合到pMNDRBBin6載體中。第十一頁(yè)，共三十頁(yè)。1M2341:陽(yáng)性對(duì)照pCAMBIA1305-1-itcol;M:1kbDNAlandderMarker;2:陰性對(duì)照pMNDRBBin6質(zhì)粒;3:陽(yáng)性克隆PCR擴(kuò)增;4:陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒PCR擴(kuò)增;M:1kbDNAladdermarker.------1.45kb第十二頁(yè)，共三十頁(yè)。(2)對(duì)整合了Rxol基因的pMNDRBBin6載體使用HpaI和XmaI進(jìn)行雙酶切，應(yīng)得到大小為

20.875kb的片段。該陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒經(jīng)酶切后產(chǎn)生1條帶約為20kb(圖2.5)，與目的基因片段和pMNDRBBin6載體的長(zhǎng)度之和相等記為pMNDRBBin6-Rxola

1M—l0kb1:質(zhì)粒;2:Marker.第十三頁(yè)，共三十頁(yè)。(3)pMNDRBBin6-Rxol經(jīng)EcoRI酶切后產(chǎn)生4個(gè)片段，大小分別為9378bp,8576bp,1632bp和1268bp(9378bp和8576bp片段長(zhǎng)度相近，圖中合為一條粗帶)(圖2.6A);SacI酶切產(chǎn)生5個(gè)片段，大小分別為8525bp,5194bp,2683bp,1763bp和1528bp(圖2.6B)

圖2.6陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的EcoRICA)和SacI(B)酶切圖譜.1:質(zhì)粒;Ml:250byDNAladdermaker;M2:1kbDNAladdermarker.上述酶切結(jié)果與PremierPrimer5.0分析的理論酶切片段大小相符，表明Rxol基因整合到了雙邊界載體中，且位于TDNA相鄰的左右邊界之間。第十四頁(yè)，共三十頁(yè)。(3)陽(yáng)性克隆酶切鑒定和PCR擴(kuò)增(4)載體序列分析(5)保存陽(yáng)性克隆，以備后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化工作。第十五頁(yè)，共三十頁(yè)。水稻的遺傳轉(zhuǎn)化

將處理好的種子誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS（含100mL/LMS大量元素混合液上，26℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)約30天。（1）繼代培養(yǎng)將上述誘導(dǎo)的質(zhì)地緊密、色澤鮮艷的胚性愈傷組織在超凈臺(tái)中用鑷子剝離，轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中（MS培養(yǎng)基，如上），2周后選擇原胚性愈傷組織分化出來的質(zhì)地均勻、顆粒較小、色澤良好的愈傷顆粒繼代一次，共繼代2次。第十六頁(yè)，共三十頁(yè)。（2）農(nóng)桿菌活化將超低溫保存的農(nóng)桿菌劃線于含50mg/L卡那霉素的YEB培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；挑取單菌落，接于2mL含有50mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床中振蕩培養(yǎng)約36小時(shí)；用移液槍吸取1mL新鮮菌液接于50mL含50mg/L卡那霉素的YEB液體培養(yǎng)基中，搖菌至OD600為0.8-1.0；將活化好的農(nóng)桿菌離心，4000rpm，10min，去上清后重懸于AAM-As（100含mL/LAAM大量元素、5mL/L上述鐵鹽、0.1mg/LVB1、0.6mg/LVB6、0.5mg/L煙酸、0.75mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、876mg/L谷氨酰胺、266mg/L天冬氨酸、175mg/L精氨酸、0.5g//L酪蛋白、68.5g/L蔗糖及36g/L葡萄糖，調(diào)節(jié)PH至5.2，滅菌后冷卻至約60℃的培養(yǎng)基中加入1mL10mmol/L的乙酰丁香酮）液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm振搖3-4小時(shí)，用分光光度計(jì)調(diào)節(jié)OD600為0.7-1.0，即可用于分裝、侵染愈傷組織。第十七頁(yè)，共三十頁(yè)。（3）侵染、共培養(yǎng)與篩選材料為在繼代培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4-5天的愈傷組織，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到滅菌濾紙上吸濕20min后轉(zhuǎn)移到調(diào)好濃度的菌液中；搖床中緩慢搖晃20-30min；倒掉菌液，于滅菌濾紙上吸棄多于菌液；取出愈傷，播于鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基（PH為5.2的MS培養(yǎng)基）中，20℃生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)2-3天。當(dāng)共培養(yǎng)的愈傷周圍出現(xiàn)明顯的菌體時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至滅菌濾紙上，吸去表面菌體后用含有150mg/L頭孢噻奎鈉和200mg/L羧芐青霉素的無菌水中，100rpm振蕩30min，重復(fù)3次；將洗過的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌濾紙上，吸取多于水分；將愈傷接入篩選培養(yǎng)基（含有150mg/L頭孢噻奎鈉和200mg/L羧芐青霉素及50mg/L潮霉素）中，26℃避光篩選15-20天后將未變黑的愈傷轉(zhuǎn)移到新的篩選培養(yǎng)基，重復(fù)2次。第十八頁(yè)，共三十頁(yè)。（4）植株再生將篩選培養(yǎng)基上的抗性愈傷組織介入預(yù)分化培養(yǎng)基（含有N6大量、MS微量、鐵鹽、1mg煙酸、10mgVB1、1mgVB6、0.1g肌醇、0.3g酪蛋白、0.5g甘氨酸、0.5g脯氨酸、30g蔗糖、3g植物凝膠、2.2mgNAA、2.5mg6-BA，PH為5.8）上，26℃暗培養(yǎng)7天后在12小時(shí)光照、12小時(shí)黑暗的條件下培養(yǎng)7天。將預(yù)分化的抗性愈傷組織接入鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，干燥處理3小時(shí)后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（每升含有N6大量、MS微量、鐵鹽、1mg煙酸、10mgVB1mgVB6、0.1g肌醇、0.3g酪蛋白、0.5g甘氨酸、0.5g脯氨酸、30g麥芽糖、3g植物凝膠、0.5mgNAA、1.5mg6-BA，PH為5.8）上，在26℃環(huán)境中12小時(shí)光照及12小時(shí)避光的條件下，培養(yǎng)至愈傷變綠，長(zhǎng)出少量根，且分化出莖葉。第十九頁(yè)，共三十頁(yè)。（5）生根培養(yǎng)當(dāng)分化的小苗生長(zhǎng)到4-5cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（每升中含25mLMS大量元素、5mLMS微量元素混合液、5mL鐵鹽、30g蔗糖、3g植物凝膠、0.1mg/LNAA、0.1g肌醇、0.3g酪蛋白、0.5g谷氨酰胺及0.5g脯氨酸，調(diào)節(jié)PH至5.8）上，上述溫度和光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng)30天左右。第二十頁(yè)，共三十頁(yè)。（6）壯苗與煉苗

將小苗經(jīng)7天溫室煉苗后，轉(zhuǎn)移到人工氣候室水培20天，再轉(zhuǎn)移至隔離的網(wǎng)室中種植。第二十一頁(yè)，共三十頁(yè)。（7）轉(zhuǎn)基因后代的表型檢測(cè)與分子檢測(cè)當(dāng)植株生長(zhǎng)到分蘗盛期時(shí)，用針刺法接種毒性Xoc小種，分別在第3天、第5天、第7天及第10天觀察記錄接種點(diǎn)的反應(yīng)表型。DNA提?。篊TAB法提取轉(zhuǎn)移至網(wǎng)室種植的基因工程苗的基因組DNA（經(jīng)液氮速凍后研磨的約0.1g葉片粉末中加入400μLCTAB提取液；65℃水浴40分鐘，期間搖晃混勻2次；8000rpm離心10分鐘后吸取上清；上清中加入等體積的24:1氯仿：異戊醇，搖床上100rpm5min；10000rp離心10分鐘；吸取轉(zhuǎn)移上清至新管，加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇后混勻；-20℃下放置30min以上；10,000rpm離心5min，棄廢液；用酒精洗兩遍，室溫下風(fēng)干，加入200μL溶解DNA;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量）。第二十二頁(yè)，共三十頁(yè)。基因檢測(cè)為了檢測(cè)所轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)，采用了Nothern雜交的方法（雜交步驟見地高辛試劑盒說明）：提取經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的植株及受體對(duì)照的DNA，用EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切后于1%瓊脂糖凝膠電泳中低電壓條件下過夜。雜交操作參照試劑盒所述方法。所用的探針為Rxo1-pCAMBIA1305-1質(zhì)粒為模板Rxo1-1F和Rxo1-1R為引物擴(kuò)增出的約1.45kb的Rxo1片段。第二十三頁(yè)，共三十頁(yè)。細(xì)菌性條斑病菌株的分離培養(yǎng)與接種鑒定

菌株分離：以從田間取具有細(xì)條病表型（水浸狀條斑，有菌膿）且無其余病害（特別是白葉枯?。?dǎo)致的癥狀的葉片為標(biāo)本，經(jīng)75%酒精表面消毒10s，放入滅菌水中清洗2min，重復(fù)3次；在滅菌水中剪碎，放置3分鐘；用滅菌接種針蘸取游離有病原細(xì)菌的處理液，在PSA培養(yǎng)基（300g土豆煮出的水中加入5g蛋白胨、15g蔗糖、0.5g硝酸鈣、0.78g磷酸氫二鈉及15g瓊脂粉，定容至1000mL）上劃線；置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天；挑取從形態(tài)與外觀上看為黃單胞菌的單菌落，擴(kuò)繁培養(yǎng)，并經(jīng)接種鑒定為正確的菌株在20%甘油的條件下置于-70℃中保存。菌體培養(yǎng)與接種：用接種針蘸取保存菌株的菌液，在上述培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)2-3天；挑取單菌落擴(kuò)繁培養(yǎng)2天；用無菌水將菌體洗下，混勻成濃度為108cells/mL；在吸滿菌液的海綿上用大頭針針刺接種不同水稻葉片；接種后3-15天內(nèi)連續(xù)觀察和記錄表型。第二十四頁(yè)，共三十頁(yè)。第二十五頁(yè)，共三十頁(yè)。轉(zhuǎn)基因植株的表型鑒定和分子鑒定

轉(zhuǎn)基因植株的獲得過程見圖2.1：經(jīng)誘導(dǎo)、繼代后的狀態(tài)良好的愈傷用于攜帶目的基因的農(nóng)桿菌侵染，再經(jīng)篩選獲得抗性愈傷，將抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中繼續(xù)篩選與分化3-5周，將分化的抗性苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后壯苗與煉苗。針刺法接種轉(zhuǎn)基因植株及受體分蘗盛期葉片的結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因植株中表現(xiàn)出明顯的抗病反應(yīng)而受體則高度感病（見圖2.2a）。如圖所示，轉(zhuǎn)基因植株葉片接種點(diǎn)僅變白，周圍未見病斑；而受體植株葉片上有明顯的條狀病斑沿著接種點(diǎn)擴(kuò)展，且病葉表面有菌膿呈現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因植株的DNA及質(zhì)粒對(duì)照的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是大小約為1.45kb的片段（如圖2.2b）。T0代轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交的結(jié)果驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因植株的外源基因?qū)霠顩r（如圖2.2c）。第二十六頁(yè)，共三十頁(yè)。

轉(zhuǎn)基因植株的抗病反應(yīng)接種后12小時(shí)的9804-Rxo1和9804植株在接種點(diǎn)沒有可見的表型差異；在空氣濕度較高的環(huán)境下，接種后24小時(shí)（