破骨細胞酸性磷酸酶染色后快速半定量分析

破骨細胞酸性磷酸酶染色后快速半定量分析何友華;童國軍;李明翰;李威;許伏龍;楊德鴻【摘要】ObjectiveToselectasuitablesolventfordissolvingosteoclasttartrateresistantacidphosphatasestai-ning(theTRAPinsitustaining);toexploretheoptimalwavelengthsoflightabsorption;andtocomparewithtartratere-sistantacidphosphatasedetectionkitmethod,thusevaluatethestabilityoffastsemi-quantitativeanalysis.MethodsSeedingthebonemarrow-derivedmacro-phages(BMMs)in24wellspretreatedwithplatecollagenI.ThecellswereextractedfromC57BL/6mice,thendividedinto4groups,10nmol/LPTH(1-34),100nmol/LPTH(1-34),1pmolPTH(1-34)/Land10pmol/LPTH(1-34)groups.ThecellswereincubatedwithPTHfor4hoursthenreplacedwithamediumcontaining10%fetalbovineserumfor44hours,4h/44hasacycle.Eightdayslater,regularTRAPinsitustainingwasperformed.SuitablesolventswerescreenedforTRAP.Aceticacidwasappliedforfinalsolved,withultrason-icgrinding.SupernatantwascollectedforassessmentofODvaluewithasuitableabsorbancewavelength,andcomparedwithtartrateresistantacidphosphatasekits.ResultsAfterTRAPinsitustaining,aceticacidwaschoseastheoptimizedsolvent.The550nmabsorbancewavelengthwasideal,wheneliminatingtheinterferenceofaceticacid.AstheincreasingoftheconcentrationofPTH(1-34),theactivityofosteoclastsincreased,andtheODvalueincreasedasthesame.TheODvalueofTRAPinsitustainingsolutionandtheODvalueoftartrateresistantacidphosphatasedetectionkitmethodhadsignificantcorrelation(r=0.986,P<0.014).ConclusionDissolvingtheTRAPinsitustainingwithaceticacid,using550nmabsorbancewavelengthcanrealizeosteoclastrapidsemi-quantitativeanalysisafterdyeing.%目的尋求合適的溶劑，溶解破骨細胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色產(chǎn)物，篩選溶液的最適檢測波長檢測溶液吸光度值.比較該方法與TRAP活性檢測試劑盒法相關(guān)性，并評價該快速半定量分析法的穩(wěn)定性與可靠性.方法提取C57BL/6小鼠骨髓來源巨噬細胞(BMMs),以1x104?mL-1均勻種入膠原I包被處理24孔板，隨機分為4組:10nmoL/LPTH(1-34),100nmoL/LPTH(1-34),1pmoL/LPTH(1-34),10pmoL/LPTH(1-34),給予甲狀旁腺素［PTH(1-34)］刺激4h后換成含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)44h,以4h/44h為1個周期，培養(yǎng)8d后，進行常規(guī)破骨細胞TRAP染色,篩選合適的溶劑溶解，最終使用冰醋酸溶解TRAP原位染色產(chǎn)物，超聲粉碎取上清,選取合適的波長檢測吸光度(OD)值，此為冰醋酸溶解定量法.另一檢測手段為目前常規(guī)使用的酶活性檢測試劑盒法，試比較冰醋酸溶解定量法與酶活性檢測試劑盒法兩者的相關(guān)性.結(jié)果常規(guī)破骨細胞原位TRAP染色后，篩選出冰醋酸的溶解效果最優(yōu).溶解后測定波長在550nm左右吸收峰理想，并排除溶劑冰醋酸本身的干擾.隨著PTH(1-34)濃度增高，表現(xiàn)出破骨效應(yīng)的增加,TRAP的活性增加,兩者的OD值相應(yīng)增加.冰醋酸溶解定量法與酶活性檢測試劑盒法存在顯著正相關(guān),Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.986(P<0.05).結(jié)論采用冰醋酸溶解定量法，并用550nm波長測定OD值，可實現(xiàn)破骨細胞TRAP染色后的快速半定量分析.【期刊名稱】《廣東醫(yī)學(xué)》【年(卷)，期】2018(039)012【總頁數(shù)】4頁(P1765-1768)【關(guān)鍵詞】TRAP原位染色;冰醋酸;半定量分析;破骨細胞;甲狀旁腺素【作者】何友華;童國軍;李明翰;李威滸伏龍;楊德鴻【作者單位】南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科廣東廣州510515;南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科廣東廣州510515浦方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科廣東廣州I510515浦方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科廣東廣州510515浦方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科廣東廣州510515浦方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科廣東廣州510515【正文語種】中文甲狀旁腺素(PTH)是一種重要的調(diào)節(jié)骨代謝的抗骨質(zhì)疏松藥物。小劑量間斷的皮下注射PTH可以用于治療絕經(jīng)后老年女性、老年男性及由糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松癥［1］。在PTH的作用機制體外研究中，PTH作用具有時間和劑量依賴性，大劑量長時間應(yīng)用促進破骨作用，導(dǎo)致骨溶解［2-3］。在研究PTH破骨作用的時候，往往需要進行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，目前主要通過大體判斷和顯微鏡下多視野計數(shù)法來判斷破骨細胞數(shù)量差別。而在成骨細胞鈣鹽的茜素紅染色后，可以用茜素紅半定量的方法間接對鈣鹽進行定量［4］。偶氮類染料在化工、印染、檢測領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，在藥物檢測，土壤和水的亞硝酸鹽檢測比較理想［5-8］。偶氮類染料涉及重氮化和偶合兩個基本反應(yīng)：芳香族伯胺在低溫、酸性條件下與亞硝酸作用生成重氮鹽的反應(yīng)稱重氮化反應(yīng)，重氮鹽正離子與活潑的芳香族化合物進行芳香親電取代生成偶氮化合物的反應(yīng)叫偶合反應(yīng)［9］。2016年3月至2017年1月，使用TRAP染色法所采用的是類似于偶氮染料反應(yīng)來進行染色，探究一種可快速將TRAP原位染色半定量的方法，將肉目艮觀察到的指標進行量化。本實驗的研究目的是篩選TRAP原位染色后所需的合適溶劑，用該溶劑溶解破骨細胞TRAP染色產(chǎn)物，選取合適的吸收波長，酶標儀測定其吸光度（OD）值；另使用傳統(tǒng)TRAP活性檢測試劑盒法測定OD值，試研究TRAP染色后半定量法與傳統(tǒng)試劑活性檢測盒法的相關(guān)性，評價該方法的應(yīng)用價值，并為TRAP原位染色的半定量提供相關(guān)研究思路。1材料與方法1.1主要儀器細胞培養(yǎng)箱（美國Galaxy公司）；IX71倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；SpectraMax?M5酶標儀（美國MolecularDevices公司）。1.2主要試劑TRAP染色試劑盒（德國Sigma-Aldrich），TRAP檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司），PTH（1-34）（廣州特立生物科技有限公司）、細胞裂解液（凱基生物）、冰醋酸（廣東光華科技股份有限公司）、a-MEM培養(yǎng)基（美國GIBCO公司）、胎牛血清（美國GIBCO公司）、青-鏈霉素（美國GIBCO公司）；70pm濾器（美國corning公司），1型膠原包被24孔板（美國corning公司）。1.3動物C57BL/6小鼠（南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）。1.4細胞培養(yǎng)8周齡C57BL/6小鼠若干只，安樂死取股骨及脛骨，75%酒精浸泡5min,a-MEM培養(yǎng)基漂洗2遍，無菌眼科剪剪開長干骨兩端，a-MEM沖洗骨髓腔，重懸，過70pm的細胞篩，濾過液體后加入紅細胞裂解液，1000r/min離心5min，去上清，重復(fù)裂解3次，10%胎牛血清重懸骨髓來源巨噬細胞（BMMs）后種板，2d后換液，待細胞匯合度達到60%~70%時，間斷使用10nmol/LPTH（1-34）,100nmol/LPTH（1-34）,1pmol/LPTH（1-34）,10pmol/LPTH（1-34）誘導(dǎo)BMMs破骨分化，PTH（1-34）刺激4h后，換10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)44h,48h1個循環(huán)，第8d行細胞TRAP原位染色。1.5TRAP染色醋酸溶解定量按照Sigma-Aldrich,387A-1K說明書，預(yù)先配好TRAP染色液，取終止培養(yǎng)的24孔板，10%中性甲醛固定10min后，用PBS沖洗3遍，每個24孔板染色液500口1,放入37°C的孵箱孵育1h后，吸干培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，鏡下觀察，冰醋酸溶解10min，刮除細胞，用超聲粉碎機粉碎，離心后取上清200"，放入96孑L板，在不同的吸光度下測量吸光度OD值，并確定最適的吸光度測定波長。1.6TRAP活性檢測應(yīng)用細胞裂解液，充分裂解細胞，離心機4C17000g離心15min取上清，按TRAP活性檢測試劑盒說明書，取適量加入反應(yīng)液混合均勻以后，37C孵育10min，在405nm下測定吸光度OD值，然后與前面的半定量法的OD值進行相關(guān)性分析。1.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以表示，進行Pearson相關(guān)性分析。2結(jié)果2.1PTH(1-34)誘導(dǎo)BMMs破骨細胞分化TRAP原位染色結(jié)果顯示，肉眼可見隨著PTH(1-34)濃度增加，TRAP染色面積逐漸增大，顏色逐漸加深，鏡下可見TRAP(+)陽性細胞數(shù)從左到右依次增多。見圖1。2.2篩選最適檢測波長取TRAP原位染色產(chǎn)物溶解的上清液和冰醋酸連續(xù)測定400~600nm的溶液吸收OD值，觀察溶液測定的最適波長，并排除冰醋酸溶劑的干擾，得出最適的檢測波長是550nm左右。見圖2。400-600nm范圍內(nèi)篩選最佳測量吸光度波長，Solution為冰醋酸溶解產(chǎn)物的吸光度OD值曲線，AceticAcid為冰醋酸的吸光度OD值曲線。2.3TRAP溶解定量及活性檢測用冰醋酸溶解定量法將4組溶解后離心取上清液，如圖3所示，顏色從1~4逐漸加深。酶標儀550nm波長相應(yīng)OD值，如表1所示，PTH(1-34)濃度增加OD值依次增大。使用酶活性檢測試劑盒法測定TRAP相對活性，如表1所示。兩組OD值進行Pearson相關(guān)分析，得出相關(guān)系數(shù)r=0.986,P=0.014,在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。冰醋酸溶解定量法的破骨細胞TRAP原位染色溶液在550nm波長測定的OD值與酶活性檢測試劑盒法測定的OD值存在明顯正相關(guān)。見圖3和表1。圖1BMMs破骨細胞的TRAP染色肉眼觀和鏡下觀(x400)圖2不同波長下的上清液吸光度值EP管編號從1~4分別是10nmoL/LPTH(1-34)、100nmoL/LPTH(1-34)、1pmoL/LPTH(1-34)、10pmoL/LPTH(1-34)4組的冰醋酸溶解定量法的上清液圖3各組上清液肉目艮觀表1不同濃度下冰醋酸溶解定量法OD值和酶活性檢測試劑盒法OD值PTH(1-34)濃度冰醋酸溶解定量法OD值酶活性檢測試劑盒法OD值10nmol/L0.127±0.0341.951±0.161100nmol/L0.143±0.0213.019±0.2481|jmol/L0.249±0.0275.012±0.31910|jmol/L0.275±0.0425.867±0.3273討論目前在骨質(zhì)疏松及骨代謝方面的研究頗多，不僅局限于研究成骨細胞促進骨形成，對破骨細胞促進骨吸收的研究也是很重要的方向［10］,成骨分化的茜素紅染色及鈣鹽定量已經(jīng)研究較成熟［4］,破骨細胞TRAP原位染色試劑盒主要使用偶氮染料染色法［9］，結(jié)果評價主要采用大體評估和多視野計數(shù)細胞方法來量化破骨細胞TRAP染色情況，以及酶活性檢測試劑盒法。前者工作量繁雜且存在較多主觀因素，后者相對成本高、檢測時間長，對酶活性依賴大，此諸多因素干擾實驗結(jié)果。目前并沒有一種較客觀的方法來直接量化肉眼所見的染色結(jié)果。因此探求一種快速且客觀的定量方法可為研究人員節(jié)約研究成本。本研究中，利用PTH(1-34)的促進破骨形成作用［11-13］,制造一個藥物促進破骨細胞分化的研究模型，使用不同濃度的PTH(1-34)進行干預(yù)，促進BMMs破骨分化，制造不同數(shù)量不同狀態(tài)的破骨細胞，其合成不同濃度梯度的TRAP，對其進行原位染色，TRAP為破骨細胞的特異性標志酶［14］,應(yīng)用偶氮偶聯(lián)組化分析法細胞內(nèi)酶活性部位呈酒紅色反應(yīng)。以萘酚二磷酸鹽為底物，偶氮副品紅為顯色劑，TRAP在酒石酸鉀鈉存在條件下將萘酚AS-BI磷酸鹽水解為萘酚AS-BI，后者與顯色劑結(jié)合形成酒紅色沉淀[15]，如圖1所示。本研究旨在將此酒紅色沉淀量化，首要問題是如何溶解TRAP原位染色產(chǎn)物以及有效溶劑的選取，溶解后測定波長值的確定，其次評價該方法的可靠性。本研究選取了不同種類的溶劑，常見的醇類、酸、堿類試劑，基于對產(chǎn)物的溶解性及產(chǎn)物穩(wěn)定性的雙重考量，我們篩選出冰醋酸，進行TRAP原位染色的溶解，如圖3所示。采用超聲粉碎法促進溶解，離心后取上清，酶標儀測定OD值。此方法在溶解產(chǎn)物的同時，又不至于破壞染色產(chǎn)物的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果表明用冰醋酸溶解定量法，目前條件下在550nm波長測得的OD值結(jié)果較為理想，如圖2所示。冰醋酸溶解定量法與酶活性檢測試劑盒法表現(xiàn)出高相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.986,P<0.05)。且冰醋酸易于獲得，成本較低，步驟簡單，可以考慮作為目前酶活性檢測試劑盒法的替代方法。關(guān)于酶活性檢測試劑盒法，方法相對繁瑣，實驗成本高，時間跨度大，結(jié)果的可靠性較大程度依賴酶穩(wěn)定性，這類系統(tǒng)誤差將會干擾研究人員對實驗結(jié)果的判斷。受限于實驗條件，本法的穩(wěn)定性也存在很多不完善的地方，但還是在依賴酶活性檢測試劑盒法之外提供了一個新的思路。本研究首次將TRAP原位染色結(jié)果快速半定量分析。本實驗研究人員會在此基礎(chǔ)之上進一步探究合適的實驗條件，以尋求更加客觀、科學(xué)的實驗流程。有利于提出一種和茜素紅染色后鈣半定量的同樣便捷的方法，真正實現(xiàn)細胞TRAP的快速半定量分析。參考文獻HodsmanAB,BauerDC,DempsterDW,etal.ParathyroidHormoneandTeriparatidefortheTreatmentofOsteoporosis:AReviewoftheEvidenceandSuggestedGuidelinesforItsUse[J].EndocRev,2005,26(5):688-703.LombardiG,DiSommaC,RubinoM,etal.Therolesofparathyroidhormoneinboneremodeling:prospectsfornoveltherapeutics[J].JEndocrinolInvest,2011,34(7Suppl):18-22.YuEW,NeerRM,LeeH,etal.Time-dependentchangesinskeletalresponsetoteriparatide:Escalatingvs.constantdoseteriparatide(PTH134)inosteoporoticwomen[J].Bone,2011,48(4):713-719.李宇琳,周恒,劉廣鵬，等.茜素紅半定量測定細胞基質(zhì)鈣含量的實驗研究[J].組織工程與重建外科雜志,2008,4(2):61-64.蘇秋寧,唐輝，劉志達.重氮化反應(yīng)及其應(yīng)用[J].精細化工中間體,2012,42(3):13-16.ShahJ,JanMR,KhanMA.DeterminationofFurosemidebySimpleDiazotizationMethodinPharmaceuticalPreparations[J].JChinChemSoc,2005,52(2):347-352.NarayanaB,SunilK.ASpectrophotometricMethodfortheDeterminationofNitriteandNitrate[J].EJAC,2009,4(76):204-214.NotAvailableNA,KumarK,BilwaM.AFacileSpectrophotometricDeterminationofNitriteUsingDiazotizationwithp-NitroanilineandCouplingwithAcetylAcetone[J].MicrochimicaActa,2001,137(3/4):249-253.秦云.重氮化與偶合反應(yīng)的理論研究[J].保山師專學(xué)報,2003,22(2):10-13.李劍，魏啟幼.PTH/PTHrP對骨代謝調(diào)節(jié)機制的研究進展[J].臨床與病理雜志,2004,24(1):54-57.LiuS,ZhuW,LiS,etal.B