破骨細(xì)胞酸性磷酸酶染色后快速半定量分析

破骨細(xì)胞酸性磷酸酶染色后快速半定量分析何友華;童國(guó)軍;李明翰;李威;許伏龍;楊德鴻【摘要】ObjectiveToselectasuitablesolventfordissolvingosteoclasttartrateresistantacidphosphatasestai-ning(theTRAPinsitustaining);toexploretheoptimalwavelengthsoflightabsorption;andtocomparewithtartratere-sistantacidphosphatasedetectionkitmethod,thusevaluatethestabilityoffastsemi-quantitativeanalysis.MethodsSeedingthebonemarrow-derivedmacro-phages(BMMs)in24wellspretreatedwithplatecollagenI.ThecellswereextractedfromC57BL/6mice,thendividedinto4groups,10nmol/LPTH(1-34),100nmol/LPTH(1-34),1pmolPTH(1-34)/Land10pmol/LPTH(1-34)groups.ThecellswereincubatedwithPTHfor4hoursthenreplacedwithamediumcontaining10%fetalbovineserumfor44hours,4h/44hasacycle.Eightdayslater,regularTRAPinsitustainingwasperformed.SuitablesolventswerescreenedforTRAP.Aceticacidwasappliedforfinalsolved,withultrason-icgrinding.SupernatantwascollectedforassessmentofODvaluewithasuitableabsorbancewavelength,andcomparedwithtartrateresistantacidphosphatasekits.ResultsAfterTRAPinsitustaining,aceticacidwaschoseastheoptimizedsolvent.The550nmabsorbancewavelengthwasideal,wheneliminatingtheinterferenceofaceticacid.AstheincreasingoftheconcentrationofPTH(1-34),theactivityofosteoclastsincreased,andtheODvalueincreasedasthesame.TheODvalueofTRAPinsitustainingsolutionandtheODvalueoftartrateresistantacidphosphatasedetectionkitmethodhadsignificantcorrelation(r=0.986,P<0.014).ConclusionDissolvingtheTRAPinsitustainingwithaceticacid,using550nmabsorbancewavelengthcanrealizeosteoclastrapidsemi-quantitativeanalysisafterdyeing.%目的尋求合適的溶劑，溶解破骨細(xì)胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色產(chǎn)物，篩選溶液的最適檢測(cè)波長(zhǎng)檢測(cè)溶液吸光度值.比較該方法與TRAP活性檢測(cè)試劑盒法相關(guān)性，并評(píng)價(jià)該快速半定量分析法的穩(wěn)定性與可靠性.方法提取C57BL/6小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMMs),以1x104?mL-1均勻種入膠原I包被處理24孔板，隨機(jī)分為4組:10nmoL/LPTH(1-34),100nmoL/LPTH(1-34),1pmoL/LPTH(1-34),10pmoL/LPTH(1-34),給予甲狀旁腺素［PTH(1-34)］刺激4h后換成含10%胎牛血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)44h,以4h/44h為1個(gè)周期，培養(yǎng)8d后，進(jìn)行常規(guī)破骨細(xì)胞TRAP染色,篩選合適的溶劑溶解，最終使用冰醋酸溶解TRAP原位染色產(chǎn)物，超聲粉碎取上清,選取合適的波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度(OD)值，此為冰醋酸溶解定量法.另一檢測(cè)手段為目前常規(guī)使用的酶活性檢測(cè)試劑盒法，試比較冰醋酸溶解定量法與酶活性檢測(cè)試劑盒法兩者的相關(guān)性.結(jié)果常規(guī)破骨細(xì)胞原位TRAP染色后，篩選出冰醋酸的溶解效果最優(yōu).溶解后測(cè)定波長(zhǎng)在550nm左右吸收峰理想，并排除溶劑冰醋酸本身的干擾.隨著PTH(1-34)濃度增高，表現(xiàn)出破骨效應(yīng)的增加,TRAP的活性增加,兩者的OD值相應(yīng)增加.冰醋酸溶解定量法與酶活性檢測(cè)試劑盒法存在顯著正相關(guān),Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.986(P<0.05).結(jié)論采用冰醋酸溶解定量法，并用550nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值，可實(shí)現(xiàn)破骨細(xì)胞TRAP染色后的快速半定量分析.【期刊名稱】《廣東醫(yī)學(xué)》【年(卷)，期】2018(039)012【總頁(yè)數(shù)】4頁(yè)(P1765-1768)【關(guān)鍵詞】TRAP原位染色;冰醋酸;半定量分析;破骨細(xì)胞;甲狀旁腺素【作者】何友華;童國(guó)軍;李明翰;李威滸伏龍;楊德鴻【作者單位】南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科廣東廣州510515;南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科廣東廣州510515浦方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科廣東廣州I510515浦方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科廣東廣州510515浦方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科廣東廣州510515浦方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科廣東廣州510515【正文語(yǔ)種】中文甲狀旁腺素(PTH)是一種重要的調(diào)節(jié)骨代謝的抗骨質(zhì)疏松藥物。小劑量間斷的皮下注射PTH可以用于治療絕經(jīng)后老年女性、老年男性及由糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松癥［1］。在PTH的作用機(jī)制體外研究中，PTH作用具有時(shí)間和劑量依賴性，大劑量長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用促進(jìn)破骨作用，導(dǎo)致骨溶解［2-3］。在研究PTH破骨作用的時(shí)候，往往需要進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，目前主要通過(guò)大體判斷和顯微鏡下多視野計(jì)數(shù)法來(lái)判斷破骨細(xì)胞數(shù)量差別。而在成骨細(xì)胞鈣鹽的茜素紅染色后，可以用茜素紅半定量的方法間接對(duì)鈣鹽進(jìn)行定量［4］。偶氮類染料在化工、印染、檢測(cè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，在藥物檢測(cè)，土壤和水的亞硝酸鹽檢測(cè)比較理想［5-8］。偶氮類染料涉及重氮化和偶合兩個(gè)基本反應(yīng)：芳香族伯胺在低溫、酸性條件下與亞硝酸作用生成重氮鹽的反應(yīng)稱重氮化反應(yīng)，重氮鹽正離子與活潑的芳香族化合物進(jìn)行芳香親電取代生成偶氮化合物的反應(yīng)叫偶合反應(yīng)［9］。2016年3月至2017年1月，使用TRAP染色法所采用的是類似于偶氮染料反應(yīng)來(lái)進(jìn)行染色，探究一種可快速將TRAP原位染色半定量的方法，將肉目艮觀察到的指標(biāo)進(jìn)行量化。本實(shí)驗(yàn)的研究目的是篩選TRAP原位染色后所需的合適溶劑，用該溶劑溶解破骨細(xì)胞TRAP染色產(chǎn)物，選取合適的吸收波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度（OD）值；另使用傳統(tǒng)TRAP活性檢測(cè)試劑盒法測(cè)定OD值，試研究TRAP染色后半定量法與傳統(tǒng)試劑活性檢測(cè)盒法的相關(guān)性，評(píng)價(jià)該方法的應(yīng)用價(jià)值，并為TRAP原位染色的半定量提供相關(guān)研究思路。1材料與方法1.1主要儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Galaxy公司）；IX71倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；SpectraMax?M5酶標(biāo)儀（美國(guó)MolecularDevices公司）。1.2主要試劑TRAP染色試劑盒（德國(guó)Sigma-Aldrich），TRAP檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司），PTH（1-34）（廣州特立生物科技有限公司）、細(xì)胞裂解液（凱基生物）、冰醋酸（廣東光華科技股份有限公司）、a-MEM培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司）、胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司）、青-鏈霉素（美國(guó)GIBCO公司）；70pm濾器（美國(guó)corning公司），1型膠原包被24孔板（美國(guó)corning公司）。1.3動(dòng)物C57BL/6小鼠（南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。1.4細(xì)胞培養(yǎng)8周齡C57BL/6小鼠若干只，安樂(lè)死取股骨及脛骨，75%酒精浸泡5min,a-MEM培養(yǎng)基漂洗2遍，無(wú)菌眼科剪剪開(kāi)長(zhǎng)干骨兩端，a-MEM沖洗骨髓腔，重懸，過(guò)70pm的細(xì)胞篩，濾過(guò)液體后加入紅細(xì)胞裂解液，1000r/min離心5min，去上清，重復(fù)裂解3次，10%胎牛血清重懸骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（BMMs）后種板，2d后換液，待細(xì)胞匯合度達(dá)到60%~70%時(shí)，間斷使用10nmol/LPTH（1-34）,100nmol/LPTH（1-34）,1pmol/LPTH（1-34）,10pmol/LPTH（1-34）誘導(dǎo)BMMs破骨分化，PTH（1-34）刺激4h后，換10%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)44h,48h1個(gè)循環(huán)，第8d行細(xì)胞TRAP原位染色。1.5TRAP染色醋酸溶解定量按照Sigma-Aldrich,387A-1K說(shuō)明書(shū)，預(yù)先配好TRAP染色液，取終止培養(yǎng)的24孔板，10%中性甲醛固定10min后，用PBS沖洗3遍，每個(gè)24孔板染色液500口1,放入37°C的孵箱孵育1h后，吸干培養(yǎng)液，用PBS沖洗3次，鏡下觀察，冰醋酸溶解10min，刮除細(xì)胞，用超聲粉碎機(jī)粉碎，離心后取上清200"，放入96孑L板，在不同的吸光度下測(cè)量吸光度OD值，并確定最適的吸光度測(cè)定波長(zhǎng)。1.6TRAP活性檢測(cè)應(yīng)用細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞，離心機(jī)4C17000g離心15min取上清，按TRAP活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，取適量加入反應(yīng)液混合均勻以后，37C孵育10min，在405nm下測(cè)定吸光度OD值，然后與前面的半定量法的OD值進(jìn)行相關(guān)性分析。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以表示，進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。2結(jié)果2.1PTH(1-34)誘導(dǎo)BMMs破骨細(xì)胞分化TRAP原位染色結(jié)果顯示，肉眼可見(jiàn)隨著PTH(1-34)濃度增加，TRAP染色面積逐漸增大，顏色逐漸加深，鏡下可見(jiàn)TRAP(+)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)從左到右依次增多。見(jiàn)圖1。2.2篩選最適檢測(cè)波長(zhǎng)取TRAP原位染色產(chǎn)物溶解的上清液和冰醋酸連續(xù)測(cè)定400~600nm的溶液吸收OD值，觀察溶液測(cè)定的最適波長(zhǎng)，并排除冰醋酸溶劑的干擾，得出最適的檢測(cè)波長(zhǎng)是550nm左右。見(jiàn)圖2。400-600nm范圍內(nèi)篩選最佳測(cè)量吸光度波長(zhǎng)，Solution為冰醋酸溶解產(chǎn)物的吸光度OD值曲線，AceticAcid為冰醋酸的吸光度OD值曲線。2.3TRAP溶解定量及活性檢測(cè)用冰醋酸溶解定量法將4組溶解后離心取上清液，如圖3所示，顏色從1~4逐漸加深。酶標(biāo)儀550nm波長(zhǎng)相應(yīng)OD值，如表1所示，PTH(1-34)濃度增加OD值依次增大。使用酶活性檢測(cè)試劑盒法測(cè)定TRAP相對(duì)活性，如表1所示。兩組OD值進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，得出相關(guān)系數(shù)r=0.986,P=0.014,在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。冰醋酸溶解定量法的破骨細(xì)胞TRAP原位染色溶液在550nm波長(zhǎng)測(cè)定的OD值與酶活性檢測(cè)試劑盒法測(cè)定的OD值存在明顯正相關(guān)。見(jiàn)圖3和表1。圖1BMMs破骨細(xì)胞的TRAP染色肉眼觀和鏡下觀(x400)圖2不同波長(zhǎng)下的上清液吸光度值EP管編號(hào)從1~4分別是10nmoL/LPTH(1-34)、100nmoL/LPTH(1-34)、1pmoL/LPTH(1-34)、10pmoL/LPTH(1-34)4組的冰醋酸溶解定量法的上清液圖3各組上清液肉目艮觀表1不同濃度下冰醋酸溶解定量法OD值和酶活性檢測(cè)試劑盒法OD值PTH(1-34)濃度冰醋酸溶解定量法OD值酶活性檢測(cè)試劑盒法OD值10nmol/L0.127±0.0341.951±0.161100nmol/L0.143±0.0213.019±0.2481|jmol/L0.249±0.0275.012±0.31910|jmol/L0.275±0.0425.867±0.3273討論目前在骨質(zhì)疏松及骨代謝方面的研究頗多，不僅局限于研究成骨細(xì)胞促進(jìn)骨形成，對(duì)破骨細(xì)胞促進(jìn)骨吸收的研究也是很重要的方向［10］,成骨分化的茜素紅染色及鈣鹽定量已經(jīng)研究較成熟［4］,破骨細(xì)胞TRAP原位染色試劑盒主要使用偶氮染料染色法［9］，結(jié)果評(píng)價(jià)主要采用大體評(píng)估和多視野計(jì)數(shù)細(xì)胞方法來(lái)量化破骨細(xì)胞TRAP染色情況，以及酶活性檢測(cè)試劑盒法。前者工作量繁雜且存在較多主觀因素，后者相對(duì)成本高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)酶活性依賴大，此諸多因素干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。目前并沒(méi)有一種較客觀的方法來(lái)直接量化肉眼所見(jiàn)的染色結(jié)果。因此探求一種快速且客觀的定量方法可為研究人員節(jié)約研究成本。本研究中，利用PTH(1-34)的促進(jìn)破骨形成作用［11-13］,制造一個(gè)藥物促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的研究模型，使用不同濃度的PTH(1-34)進(jìn)行干預(yù)，促進(jìn)BMMs破骨分化，制造不同數(shù)量不同狀態(tài)的破骨細(xì)胞，其合成不同濃度梯度的TRAP，對(duì)其進(jìn)行原位染色，TRAP為破骨細(xì)胞的特異性標(biāo)志酶［14］,應(yīng)用偶氮偶聯(lián)組化分析法細(xì)胞內(nèi)酶活性部位呈酒紅色反應(yīng)。以萘酚二磷酸鹽為底物，偶氮副品紅為顯色劑，TRAP在酒石酸鉀鈉存在條件下將萘酚AS-BI磷酸鹽水解為萘酚AS-BI，后者與顯色劑結(jié)合形成酒紅色沉淀[15]，如圖1所示。本研究旨在將此酒紅色沉淀量化，首要問(wèn)題是如何溶解TRAP原位染色產(chǎn)物以及有效溶劑的選取，溶解后測(cè)定波長(zhǎng)值的確定，其次評(píng)價(jià)該方法的可靠性。本研究選取了不同種類的溶劑，常見(jiàn)的醇類、酸、堿類試劑，基于對(duì)產(chǎn)物的溶解性及產(chǎn)物穩(wěn)定性的雙重考量，我們篩選出冰醋酸，進(jìn)行TRAP原位染色的溶解，如圖3所示。采用超聲粉碎法促進(jìn)溶解，離心后取上清，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。此方法在溶解產(chǎn)物的同時(shí)，又不至于破壞染色產(chǎn)物的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果表明用冰醋酸溶解定量法，目前條件下在550nm波長(zhǎng)測(cè)得的OD值結(jié)果較為理想，如圖2所示。冰醋酸溶解定量法與酶活性檢測(cè)試劑盒法表現(xiàn)出高相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.986,P<0.05)。且冰醋酸易于獲得，成本較低，步驟簡(jiǎn)單，可以考慮作為目前酶活性檢測(cè)試劑盒法的替代方法。關(guān)于酶活性檢測(cè)試劑盒法，方法相對(duì)繁瑣，實(shí)驗(yàn)成本高，時(shí)間跨度大，結(jié)果的可靠性較大程度依賴酶穩(wěn)定性，這類系統(tǒng)誤差將會(huì)干擾研究人員對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。受限于實(shí)驗(yàn)條件，本法的穩(wěn)定性也存在很多不完善的地方，但還是在依賴酶活性檢測(cè)試劑盒法之外提供了一個(gè)新的思路。本研究首次將TRAP原位染色結(jié)果快速半定量分析。本實(shí)驗(yàn)研究人員會(huì)在此基礎(chǔ)之上進(jìn)一步探究合適的實(shí)驗(yàn)條件，以尋求更加客觀、科學(xué)的實(shí)驗(yàn)流程。有利于提出一種和茜素紅染色后鈣半定量的同樣便捷的方法，真正實(shí)現(xiàn)細(xì)胞TRAP的快速半定量分析。參考文獻(xiàn)HodsmanAB,BauerDC,DempsterDW,etal.ParathyroidHormoneandTeriparatidefortheTreatmentofOsteoporosis:AReviewoftheEvidenceandSuggestedGuidelinesforItsUse[J].EndocRev,2005,26(5):688-703.LombardiG,DiSommaC,RubinoM,etal.Therolesofparathyroidhormoneinboneremodeling:prospectsfornoveltherapeutics[J].JEndocrinolInvest,2011,34(7Suppl):18-22.YuEW,NeerRM,LeeH,etal.Time-dependentchangesinskeletalresponsetoteriparatide:Escalatingvs.constantdoseteriparatide(PTH134)inosteoporoticwomen[J].Bone,2011,48(4):713-719.李宇琳,周恒,劉廣鵬，等.茜素紅半定量測(cè)定細(xì)胞基質(zhì)鈣含量的實(shí)驗(yàn)研究[J].組織工程與重建外科雜志,2008,4(2):61-64.蘇秋寧,唐輝，劉志達(dá).重氮化反應(yīng)及其應(yīng)用[J].精細(xì)化工中間體,2012,42(3):13-16.ShahJ,JanMR,KhanMA.DeterminationofFurosemidebySimpleDiazotizationMethodinPharmaceuticalPreparations[J].JChinChemSoc,2005,52(2):347-352.NarayanaB,SunilK.ASpectrophotometricMethodfortheDeterminationofNitriteandNitrate[J].EJAC,2009,4(76):204-214.NotAvailableNA,KumarK,BilwaM.AFacileSpectrophotometricDeterminationofNitriteUsingDiazotizationwithp-NitroanilineandCouplingwithAcetylAcetone[J].MicrochimicaActa,2001,137(3/4):249-253.秦云.重氮化與偶合反應(yīng)的理論研究[J].保山師專學(xué)報(bào),2003,22(2):10-13.李劍，魏?jiǎn)⒂?PTH/PTHrP對(duì)骨代謝調(diào)節(jié)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].臨床與病理雜志,2004,24(1):54-57.LiuS,ZhuW,LiS,etal.B