DNA重組技術(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

頁(yè)眉內(nèi)容頁(yè)眉內(nèi)容重組DNA技術(shù)二、試驗(yàn)?zāi)康模毫私獍盐誅NA重組技術(shù)理論根底；把握質(zhì)粒載體、外源DNA的預(yù)備、酶切、連接技術(shù)方法；把握連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化方法及操作；把握陽(yáng)性重組體的的鑒定和篩選方法；三、試驗(yàn)原理:1.DNA重組DNA技術(shù)是指在體外通過(guò)人工“剪切”和“拼接”等方法，對(duì)各種生物的基因〕技術(shù)。它主要包括以下幾個(gè)步驟：①目的基因的獵?。褐饕谢瘜W(xué)合成、PCR、基因組文庫(kù)、cDNA文庫(kù)構(gòu)建mRNADNA，再?gòu)?fù)制成雙鏈cDNAcDNA信息，總稱(chēng)cDNA文庫(kù)。常用于篩選編碼蛋白質(zhì)的構(gòu)造基因。基因組DNA文庫(kù)是利用限制性核酸內(nèi)切酶將組織或細(xì)胞染色體DNA體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，這些受體菌包含了全部基因組DNA信息，因此稱(chēng)為基因組DNA文庫(kù)。②基因載體的選擇與構(gòu)建：常用載體有質(zhì)粒、噬菌體、病毒DNA等。分為物。選擇好的載體與目的基因利用限制性?xún)?nèi)切酶切割成適宜片段。③目的基因與載體的拼接：通過(guò)粘性末端連接法〔同源互補(bǔ)粘性末端連接、③目的基因與載體的拼接：通過(guò)粘性末端連接法〔同源互補(bǔ)粘性末端連接、〕、平端連接、人工接頭連接、同聚物接尾、經(jīng)局部補(bǔ)平的不匹配末端的連接等將目的基因與載體進(jìn)展連接。④重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞：將連接有目的DNA的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，主要有以下幾種方法：a、轉(zhuǎn)化：將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入宿主細(xì)胞(常用大腸桿菌)，并使其獲得的表型的過(guò)程。b、轉(zhuǎn)染：將外源DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的過(guò)程。c、感染：以噬菌體、柯斯質(zhì)粒和病毒為載體的重組DNA分子，在體外內(nèi)擴(kuò)增。檢測(cè)法等進(jìn)展間接篩選。⑥無(wú)性生殖轉(zhuǎn)化子(含重組分子的受體細(xì)胞)⑦目的基因的表達(dá)2、質(zhì)粒酶切及鑒定原理限制性?xún)?nèi)切酶是一種工具酶，其特點(diǎn)是具有能夠識(shí)別雙鏈DNA分子上的特異核苷酸序列的力氣，能在這個(gè)特異性核苷酸序列內(nèi)，切斷DNA雙鏈，形成確定長(zhǎng)度的DNA序列。依據(jù)限制性?xún)?nèi)切酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類(lèi)，IIII型酶可供給粘性未端，有利于片段再連接，限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒DNA產(chǎn)生的酶切片段數(shù)與切口數(shù)全都。因此，鑒定酶切后的片段在電;從片段遷移率可推斷酶切片段大小。用分子量的線狀DNA為比照，通過(guò)電泳遷移率的比較，可以粗略地測(cè)出分子外形一樣的未知DNABamHI和HindIII。DNA回收，回收的目的是為了純化提取的質(zhì)粒，以用于以后的分子DEAE濾膜插片法等，其中柱純化回收法、電〔柱純化回收法DNADNA。CP3吸附柱、收集管、培育皿、酒精燈、玻璃涂布棒等。五、主要試驗(yàn)試劑：1.1.pUC18DNλDN〔TIANGEN,MD202HindIIThermo,ER0501ER0501〕、BufferR(10X)〔Thermo,BR5〕、BamHI〔Thermo,ER0051〕、BamHI-Lsp1109IBuffer(10X)BamHI-Lsp1109IBuffer(10X)〔Thermo,B57〕pUC18-mir203DNA〔老師供給〕。師供給〕。2.GoldVie1kbDNALaddrTIANGEMD11DNAloadingbuffer〔6X〕〔TIANGEN,RT201-01〕，電泳緩沖液。3DNADNA〔莊盟國(guó)際生物，ZP202〕。重組體構(gòu)建相關(guān)試劑：T4DNA連接酶(Thermo,EL0014)、10XT4DNAFermentas,00044933)。轉(zhuǎn)化相關(guān)試劑：感受態(tài)細(xì)胞〔本試驗(yàn)用感受態(tài)細(xì)胞DH5α從公司購(gòu)置〕、LB培育基〔教師供給〕、含Amp瓊脂糖平皿〔教師供給〕、質(zhì)粒小量提取試劑盒〔莊盟國(guó)際生物，ZP101〕、ddH2O等。六、試驗(yàn)步驟：pUC18DNA酶切試劑pUC18DNA(5ug)10×buffer試劑pUC18DNA(5ug)10×bufferHindⅢ(15U)體積(ul)2.525ddHddH2Ototal10.520反響條件：372hr；室溫下放置等待連接?！?〕目的DNA酶切反響體系：試劑體積(ul)λDNA(5ug)1010×buffer2HindIII(9U)3ddH2O5total20反響條件：372hr；〔3〕質(zhì)粒載體雙酶切反響體系：試劑體積(ul)DNA(4μg)2510×buffer5HindIII(9U)2BamHI1ddH2O17total50反響條件：372hr；依據(jù)以上反響體系配制好后，瞬時(shí)離心后置于37℃恒溫水浴鍋中反響。目的DNA酶切片段電泳鑒定〔1〔1〕1%瓊脂糖凝膠：0.5克瓊脂糖，置于錐形瓶?jī)?nèi)，參與50ml1×TAE1%2.5μLGoldView。留神混勻并倒在1mm深的足夠電泳緩沖液，預(yù)備電泳。沖液，預(yù)備電泳。〔〔2〕電泳：20uL4uLDNAloadingbuffer混勻，20uL。90V40-60min?！?〕紫外燈下觀看結(jié)果并切膠用于后續(xù)試驗(yàn)。DNA凝膠條帶切割及目的DNA回收依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下〔盡量切除多余局部〕放入0.3g。斷溫存地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解?！参街湃胧占苤小常?2,000rpm(~13,400×g1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。向吸附柱中參與600μl漂洗液W2〔使用前參與無(wú)水乙醇rpm(~13,400×g1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中?！?〕500μlW2，12,000rpm(~13,400×g1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。將吸附柱放入收集管中，12,000rpm(~13,400×g)離心2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。50μl的洗TE，12,000rpm(~13,400×g)離心1分鐘，收集DNA溶液。DNADNA反響體系：試劑體積(ul)pUC18質(zhì)粒載體2DNA2T4DNA連接酶110×buffer1ddH2O4totaltotal10配置好以上反響體系，瞬離混勻后，室溫，過(guò)夜。轉(zhuǎn)化DH5α，冰浴中溶化。Ep50μlDH5α2μlDNA30min。4290s2min。然后參與900ulLB液體培育基，置于373h〔160rpm〕。4000r/min2200uL上清液將菌體打散，并均勻涂布AmpLB15min37℃培育箱中培育過(guò)夜。AmpLB液體培育基〔15mL〕離心管37℃恒溫?fù)u床過(guò)夜培育〔160rpm〕。陽(yáng)性重組子的克隆16h左右時(shí)，LB培育基外表長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的菌落，此時(shí)用滅菌〕，連同槍頭一起放入盛陽(yáng)性重組子的酶切鑒定質(zhì)粒提取〔依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作〕12,000rpm(~13,400×g)離心1分鐘，保存沉淀，盡量吸除上清。250μl溶液1〔使用前參與RNaseA〕，用移液槍吹打徹底懸浮細(xì)菌沉淀。裂解菌體：向離心管中參與250μl溶液2，溫存地上下翻轉(zhuǎn)6－8次使DNA，造DNA片斷。350μl溶液36–8次，12,000rpm(~13,400×g)離心10〔吸附柱放入收集管中〕，留意盡量不要吸出沉淀。12,000rpm(~13,400×g)離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。留意：溶液3參與后應(yīng)馬上混合，避開(kāi)產(chǎn)生局部沉淀。假設(shè)上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。向吸附柱中參與700μl漂洗液W2〔請(qǐng)檢查是否已參與無(wú)水乙醇30-60中。秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。將吸附柱放入收集管中,12,000rpm(~13,400×g)離心2分鐘，目的是〔酶切、PCR等〕試驗(yàn)。為確保下游試驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱開(kāi)蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中剩余的漂洗液。將吸附柱置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加60-100μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2分鐘，12,000rpm(~13,400×g)離心1分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。j.對(duì)提取的重組質(zhì)粒進(jìn)展酶切鑒定?！矖l件允許可送公司測(cè)序〕重組質(zhì)粒酶切酶切反響體系：試劑體積(ul)pUC18DNA+λDNA片段連接產(chǎn)物2.510×buffer2HindIII(15U)5ddH2O10.5total20反響條件：37℃恒溫水浴，2.5hr電泳進(jìn)展鑒定條件：90V，40-60min。紫外燈下觀看電泳結(jié)果。七．試驗(yàn)結(jié)果及分析質(zhì)粒及目的基因酶切結(jié)果如以下圖，編號(hào)1—14上樣孔道依次為：makerpUC18質(zhì)粒酶切，pUC18-mir203質(zhì)粒雙酶切，pUC18質(zhì)粒酶切，λDNA酶切，pUC18質(zhì)粒酶切，pUC18-mir203質(zhì)粒雙酶切，maker，λDNA酶切，pUC18質(zhì)粒酶切，pUC18質(zhì)粒酶切，pUC18-mir203質(zhì)粒雙酶切，pUC18-mir203質(zhì)粒雙酶切，pUC18質(zhì)粒酶切。結(jié)果分析：(1)首先四組同學(xué)進(jìn)展了雙酶切試驗(yàn)，但是電泳后紫外燈下觀看酶切后產(chǎn)生多條條帶，依據(jù)說(shuō)明書(shū)，酶切后產(chǎn)生564bp，2027bp，2322bp，4361bp，6557bp，9416bp，23130bp條帶。但maker不適宜，所以不能較準(zhǔn)確地推斷條帶大小。DNA凝膠條帶切割及目的DNA回收0.3g，切0.28gDNADNA。重組體轉(zhuǎn)化及篩選如左圖所示：轉(zhuǎn)化后的DH5αAmp的瓊脂糖平皿，3724小時(shí)后，在培育皿上可見(jiàn)陽(yáng)性單菌落。DH5α涂布于瓊脂糖平皿中，3724右圖所示，培育皿底長(zhǎng)滿(mǎn)了菌落，僅在邊緣存在少量的單菌落。說(shuō)明DH5α活力良好。試驗(yàn)中還需設(shè)置一個(gè)陰性比照孔，馬上DH5α涂布于含Amp的瓊脂糖平皿中。以后試驗(yàn)中需完善。挑取單克隆到含Amp的液體LB