外源基因的表達檢測及遺傳特性

外源基因的表達檢測及遺傳特性第一頁，共五十四頁，2022年，8月28日第一章轉(zhuǎn)化外源基因在植物細胞中的表達調(diào)控第一節(jié)轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時表達和穩(wěn)定表達第二節(jié)DNA序列對轉(zhuǎn)化外源基因表達的調(diào)控第三節(jié)DNA甲基化對轉(zhuǎn)化外源基因表達的調(diào)控第四節(jié)提高轉(zhuǎn)化外源基因表達的策略第二頁，共五十四頁，2022年，8月28日第一節(jié)轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時表達和穩(wěn)定表達 一、轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時表達在合適的條件下，轉(zhuǎn)化的外源基因通常在數(shù)小時后就能檢測到其表達的產(chǎn)物，并在1-2天內(nèi)達到最高值，隨后又逐漸降低，至十多天后完全消失。這種短時間內(nèi)的外源基因表達稱之為瞬時表達。第三頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.外源基因瞬時表達的機制（1）瞬時表達是未整合的外源基因的表達（2）瞬時表達是一種正常的表達方式 基因擴增是指細胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專一性地大量增加的現(xiàn)象。擴增的基因片斷游離在細胞核內(nèi)。第四頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.外源基因瞬時表達的影響因素（1）質(zhì)粒DNA的基因結(jié)構(gòu)；（2）細胞內(nèi)源核酸酶的影響；（3）受體細胞生理狀態(tài)及其內(nèi)源Gus酶抑制劑的影響；第五頁，共五十四頁，2022年，8月28日3.外源基因瞬時表達的應用（1）在基因轉(zhuǎn)化研究中的應用 ①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力的檢測； ②優(yōu)化基因轉(zhuǎn)化條件，選擇導入DNA的方法，確定農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的時間等。（2）植物基因表達調(diào)控的研究 ①啟動子、增強子、內(nèi)含子、終止子的功能研究； ②外界因素對基因表達調(diào)控的影響； ③植物激素的調(diào)控機理。第六頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、轉(zhuǎn)化外源基因的穩(wěn)定表達

所謂穩(wěn)定表達是指外源基因整合到和基因組DNA分子上，并能穩(wěn)定地遺傳的外源基因的表達。需符合以下條件： （1）表達時間長，無迅速衰退現(xiàn)象； （2）DNA已整合到植物基因組中； （3）能夠傳遞給后代，并符合分離規(guī)律。第七頁，共五十四頁，2022年，8月28日第二節(jié)DNA序列對轉(zhuǎn)化外源基因表達的調(diào)控一、植物基因工程中常用的啟動子按作用方式及功能不同可將啟動子分為三類：組成型啟動子2.組織特異性啟動子3.誘導型啟動子第八頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.組成型啟動子

在該類型啟動子控制下，結(jié)構(gòu)基因的表達大體恒定在一定水平上，在不同組織部為表達水平也沒有明顯差異，為此稱之為非特異性表達組成型啟動子。其特點是：表達具持續(xù)性；表達量相對穩(wěn)定；不表現(xiàn)時空特異性；不受外界因素誘導；在結(jié)構(gòu)上存在六聚體花紋序列（TGACTG），往往以重復形式出現(xiàn)并被6-8個核苷酸隔開。第九頁，共五十四頁，2022年，8月28日（1）CaMV35S啟動子 該啟動子來自花椰菜花葉病毒（CaMV），其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的沉降系數(shù)為35S，故名。 最近發(fā)現(xiàn)35S啟動子可以劃分為兩個區(qū)域：從-90~+8為A區(qū)域，主要負責在胚根、胚乳的根及根組織內(nèi)表達；從-343~-90為B區(qū)域，主要負責在胚的子葉及成熟植株的葉組織及維管組織內(nèi)表達，在B區(qū)域內(nèi)的增強子序列可以提高表達水平。第十頁，共五十四頁，2022年，8月28日（2）Nos和Oct啟動子

來自與根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的胭脂堿合成酶基因和章魚堿合成酶基因，具有與植物基因相似的序列。第十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.組織特異性啟動子

也稱為器官特異性啟動子，在這類啟動子的調(diào)控下，基因的表達往往只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。這種特異性通常以特定的組織細胞結(jié)構(gòu)和化學物理信號為存在的基礎。典型的組織特異性啟動子有：馬鈴薯塊莖蛋白基因啟動子；小麥胚乳特異表達的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因啟動子；番茄果實成熟特異性表達的多聚半乳糖醛酸酶基因啟動子；花粉特異表達基因（lat52）啟動子和木質(zhì)部特異表達的苯丙氨酸脂肪酶基因（pal）啟動子等。第十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日3.誘導型啟動子

所謂誘導型啟動子就是在某些特定的物理或化學信號的刺激下，可以大幅度地提高基因轉(zhuǎn)錄水平的啟動子。該類啟動子常以誘導信號命名，如光誘導表達基因啟動子；熱誘導表達基因啟動子；創(chuàng)傷誘導表達基因啟動子；真菌誘導表達基因啟動子等。第十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、終止子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用

不同來源的有著很大影響。使用35S啟動子與NPTII結(jié)構(gòu)基因形成共整合體，并于不同來源的終止子構(gòu)建成融合基因，轉(zhuǎn)化煙草。發(fā)現(xiàn)不同的終止子使NPTII基因的表達水平可相差60倍。植物基因的終止密碼子多用UGA，而在雙子葉植物中，UAA的使用頻率高于UGA。第十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日三、5’，3’端序列對外源基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控作用

基因的整體表達過程包括：轉(zhuǎn)錄、初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工、運輸、mRNA的翻譯以及蛋白產(chǎn)物的后加工這一系列步驟，每個步驟上都存在著復雜而精細的調(diào)節(jié)，只提高外源基因的轉(zhuǎn)錄活性并不能有效地提高細胞中相應的mRNA水水平和蛋白含量。分析和改造轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、提高mRNA的穩(wěn)定性和翻譯活性是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控研究的重點。第十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.5’端帽序列的調(diào)控

帽子結(jié)構(gòu)不僅能提高翻譯起始頻率，還能保護mRNA免遭外且核酸酶的破壞，提高mRNA的穩(wěn)定性。第十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.5’端先導序列的調(diào)控 從真核基因mRNA5’端帽子到起始密碼子之間的不翻譯核苷酸序列稱為先導序列。先導序列的結(jié)構(gòu)、組成和長度對翻譯效率的影響是存在的，但不是絕對的。TMV基因組RNA68堿基的先導序列和AMVRNA436堿基的先導序列具有提高外源基因mRNA翻譯活性的功能。第十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日3.poly(A)及其信號序列的調(diào)控

poly(A)和某些蛋白因子的結(jié)合能保護mRNA免遭外切核酸酶的降解。 3’端聚腺苷酸信號附近的一些核苷酸序列能夠促進提高植物基因表達水平，很可能是通過促進mRNA加工和增加其穩(wěn)定性而發(fā)揮作用。第十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日四、內(nèi)含子對轉(zhuǎn)化外源基因的表達調(diào)控作用

1.內(nèi)含子有利于基因的變異進化 （1）有利于在內(nèi)含子序列之間發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的基因； （2）內(nèi)含子切割點的變異導致外顯子延伸。 2.內(nèi)含子具有提高外源基因表達水平的作用 由于內(nèi)含子的有效拼接提高了細胞中成熟mRNA的水平，從而有利于基因表達。第十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日五、信號肽序列對轉(zhuǎn)化外源基

因翻譯產(chǎn)物的調(diào)控作用

翻譯的完成不是基因表達的結(jié)束，初級翻譯產(chǎn)物并不具有生物活性，稱之為前體蛋白。它通常還需要加工、修飾和正確折疊才能成為有活性的蛋白。前體蛋白的信號肽與活性蛋白的成熟有關(guān)、也與蛋白質(zhì)的運輸和分泌有關(guān)。第二十頁，共五十四頁，2022年，8月28日第三節(jié)甲基化對轉(zhuǎn)化外源基因的表達調(diào)控

DNA甲基化現(xiàn)象廣泛地存在于動植物細胞中，有許多重要的生物學功能，包括DNA復制起始、突變、修飾限制系統(tǒng)等。通過改變DNA的甲基化狀態(tài)可以調(diào)控基因的表達。第二十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.DNA甲基化的作用機制

（1）甲基化影響DNA與蛋白質(zhì)的相互識別與作用； （2）甲基化影響DNA的構(gòu)象，從而調(diào)節(jié)DNA的基因活性。 如以5-氮胞嘧啶核苷取代胞苷，誘導消除甲基化修飾，可使基因激活。第二十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.DNA甲基化在轉(zhuǎn)基因植物中的作用

眾多實驗表明，DNA甲基化嚴重影響外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達水平。第二十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日第四節(jié)提高轉(zhuǎn)化外源基因表達的策略

一、克服轉(zhuǎn)化外源基因失活的策略 1.篩選單拷貝轉(zhuǎn)基因株系； 2.核基質(zhì)附著區(qū)的使用； 3.誘導型表達啟動子的使用； 4.基因DNA序列的改造。 二、啟動子、增強子、終止子、內(nèi)含子、5’和3’

端調(diào)控序列的使用 三、優(yōu)化先導序列，提高翻譯效率第二十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日第二章外源基因整合的鑒定

為獲得真正的轉(zhuǎn)基因植株，進行基因轉(zhuǎn)化后要進行以下工作：第一步：篩選轉(zhuǎn)化細胞；第二步：對轉(zhuǎn)化植株進行分子生物學鑒定，Southern、Northern、Western。第三步：性狀鑒定；第四步：遺傳學分析，獲得轉(zhuǎn)基因品種。第二十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日第一節(jié)

Southern雜交 Southern雜交用于檢測和分析外源基因的整合情況。用標記的外源基因（或片斷）做探針，與植物細胞染色體DNA進行雜交。具體的檢測方法有Southern斑點雜交和Southern印跡雜交兩種。下面以Southern印跡雜交為例加以介紹。第二十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日一、植物總DNA提取1.植物總DNA提取提取原理及方法概述2.植物總DNA提取的實驗設計3.植物DNA樣品純度及濃度的檢測4.植物DNA樣品的保存第二十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.植物總DNA提取原理及方法概述（1）CTAB法 原理：CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB與核酸的復合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開。然后將CTAB與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶于乙醇。第二十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日

方法：1.取1-50克新鮮植物材料，于液氮中研磨成粉。2.將凍粉轉(zhuǎn)入預冷的離心管中，立即加入等體積（w/v）65℃預熱的2xCTAB提取緩沖液，充分混勻，65℃保溫10-20分鐘，其間不時搖動。3.加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒離心管混勻，室溫下12000rpm離心10-20分鐘。4.將上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，假如1/10體積的10%CTAB，混勻，加入等體積的氯仿/異戊醇，顛倒離心管混勻，室溫下12000rpm離心10-20分鐘。5.取上相，重復4操作一次。第二十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日6.將上相轉(zhuǎn)入新的離心管，加入1-1.5倍體積的1xCTAB沉淀緩沖液，混勻，室溫下放置30分鐘，沉淀。7.3500-4000rpm離心5-10分鐘，去上清，沉淀吹干。8.按0.5ml/g材料的比例加入1mol/L乙酸銨溶液，使沉淀溶解完全，再加入7.5mol/L乙酸銨至終濃度為2.5mol/L.9.加入2倍體積的異戊醇，混勻，室溫下放置10分鐘。10.10000rpm離心5分鐘，去上清。11.用70%乙醇漂洗沉淀，吹干，沉淀溶于適量TE。優(yōu)點：能很好的去除糖類雜質(zhì)，對于含糖較高的材料可優(yōu)先采用。第三十頁，共五十四頁，2022年，8月28日（2）SDS法原理：利用高濃度的SDS，在較高溫度（55-65℃）條件下裂解細胞，使染色體離析，蛋白質(zhì)變性，釋放出核酸，然后采用提高鹽濃度及降低溫度的方法使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀（最常用的是加入5mol/L的KAC于冰上保溫，低溫條件下KAC與蛋白質(zhì)及多糖結(jié)合成不溶物），離心除去沉淀后，上清中的DNA反復用酚/氯仿抽提，用乙醇沉淀水相中的DNA。第三十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日（3）植物總DNA提取時常遇到的問題1.植物材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，使DNA呈褐色。解決辦法：提高CTAB提取緩沖液中巰基乙醇的含量或在SDS提取液中加入6%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。2.植物細胞壁難以破碎。解決辦法：在SDS提取液中加入蛋白酶K，在液氮冷凍條件下研磨。第三十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.植物DNA樣品純度及濃度的鑒定

用于Southern雜交的植物DNA樣品在純度、長度及濃度上均有較高的要求。純度上應無蛋白質(zhì)、RNA、多糖及抑制限制性內(nèi)切酶活性的物質(zhì)；在長度上不應低于50kb；濃度應在0.5-1μg/μl之間。目前主要采用瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法進行檢測。第三十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日（1）瓊脂糖凝膠電泳 1.所提植物DNA應呈現(xiàn)出一條分子量較大的清晰條帶。如樣品呈彌散狀，說明DNA已嚴重降解，可能原因是：所用的器皿及試劑是否滅菌；材料收集后是否立即冷凍，研碎過程中或研碎后進入提取液前是否融化；是否有劇烈振動、吸管口過窄、產(chǎn)生起泡、反復吹打等操作。 2.如在溴酚蘭處出現(xiàn)明亮的熒光區(qū)，說明RNA過多，可用RNA酶消化。 3.如在樣品槽內(nèi)有熒光出現(xiàn)，說明DNA為完全溶解或濃度過高，或樣品不純。 4.估算樣品的濃度。第三十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日（２）紫外分光光度法測定

1.純度： 純凈的DNA溶液其OD260／OD280應為1.8，OD260／OD230應大于2.0。如果OD260／OD280大于1.8，表明應中含有較多的RNA；如果OD260／OD280小于1.6，則說明樣品中蛋白質(zhì)較多；OD260／OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的小分子及鹽類雜質(zhì)，可增加70%乙醇洗滌沉淀的次數(shù)。 2.濃度： DNA樣品濃度（μg/μl）=OD260×稀釋倍數(shù)×0.05第三十五頁，共五十四頁，2022年，8月28日二、雜交探針的制備

探針是指經(jīng)特殊化和物標記的特定的核苷酸序列。用于檢測植物基因組中外源基因整合的探針應為同源探針，一般長度在300bp以上。 雜交探針的制備包括探針核苷酸序列的獲取和標記兩部分內(nèi)容。第三十六頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.探針核苷酸序列的獲?。?）人工合成；（2）從質(zhì)粒上切?。ㄙ|(zhì)粒DNA的制備質(zhì)粒DNA樣品純度及濃度的檢測質(zhì)粒DNA的酶切探針片斷的回收）。第三十七頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.探針標記（1）標記物理想的標記物應滿足以下條件：1.標記前后探針的基本結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相同；2.檢測靈敏度高、特異性強、本底低、重復性好且操作簡便、節(jié)時；3.穩(wěn)定、安全、無環(huán)境污染；4.經(jīng)濟。第三十八頁，共五十四頁，2022年，8月28日表一、標記物類別放射性標記物放射性標記物生物素類酶類半抗原熒光素其他3H14C32P33P125I131I35S生物素光敏生物素堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶地高辛配基異硫氰酸熒光素、羅達明、四甲基異硫氰酸汞離子、AAF、AAIF、金、銀第三十九頁，共五十四頁，2022年，8月28日（2）標記方法

1.切口平移法 2.隨機引物法 3.末端標記法 4.化學標記法第四十頁，共五十四頁，2022年，8月28日1.切口平移法

利用微量的DNA酶I使待標記的雙鏈DNA分子產(chǎn)生若干單鏈缺口，然后E.coliDNA聚合酶I的5’3’外切作用在切口的5’端將脫氧核苷酸逐個切下，同時該酶的3’5’聚合或性誘使反應體系中的核苷酸底物按模板要求依次連接到切口的3’羥基處。第四十一頁，共五十四頁，2022年，8月28日2.隨機引物法

隨機引物法是近幾年來興起的一種有效的標記方法，在反應體系中加入寡核苷酸引物，模板DNA變性成單鏈后與寡核苷酸引物雜交，形成局部的雙鏈區(qū)，DNA聚合酶以引物的3’-OH為起始點，按照模板的順序形成互補的探針。 該方法有如下優(yōu)點：要求模板純度不是很高；反應比較穩(wěn)定；標記的探針比活性高；可在低溶點瓊脂糖中反應。第四十二頁，共五十四頁，2022年，8月28日3.末端標記法

5’末端標記常用T4多聚核苷酸激酶，標記物常用[-32P]ATP。 3’末端標記常用末端轉(zhuǎn)移酶，，該酶催化[-32P]dNTP加到3’末端。第四十三頁，共五十四頁，2022年，8月28日4.化學標記法

酶法是先將標記物標記在核苷酸上，然后再通過酶促聚合反應使帶標記的核苷酸摻入到核酸序列中。 化學法是通過標記物的活性基團與核酸分子中的某個基團發(fā)生化學反應而進行標記。 酶法目前使用較多，但標記程序復雜，費用高；化學法的主要問題是試劑及操作因標記物不同而不同，沒有一個常規(guī)的方法。第四十四頁，共五十四頁，2022年，8月28日三、Southern印跡雜交1.Southern印跡雜交原理2.Southern印跡雜交的實驗樣品3.Southern印跡雜交的實驗程序第四十五頁，共五十四頁，2022年，8月28