慢病毒載體包裝構(gòu)建過(guò)程

創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日慢病毒載體包裝建立過(guò)程之巴公井創(chuàng)始作創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日原理：慢病毒載體能夠?qū)⑼庠椿蚧蛲庠吹膕hRNA有效地整合到宿主染色體上，進(jìn)而達(dá)到長(zhǎng)久性表達(dá)目的序列的成效。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種種類(lèi)的細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到優(yōu)秀的的基因治療成效。關(guān)于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體，能大大提升目的基因或目的shRNA的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主細(xì)胞基因組的幾率大大增添，能夠比較方便快捷地實(shí)現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長(zhǎng)久、穩(wěn)固表達(dá)。觀(guān)點(diǎn)：慢病毒載體是指以人類(lèi)免疫缺點(diǎn)病毒-1(HIV-1)根源的一種病毒載體，慢病毒載體包括了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)固整合所需要的遺傳信息，是慢病毒載系統(tǒng)統(tǒng)的主要構(gòu)成部分。攜帶有外源基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的協(xié)助下，經(jīng)過(guò)病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，經(jīng)過(guò)感染細(xì)胞或活體組織，實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或活體組織中表達(dá)。協(xié)助成分：慢病毒載體協(xié)助成分包括：慢病毒包裝質(zhì)粒和可發(fā)患病毒顆粒的細(xì)胞系。慢病毒載體包括了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)固整合所需要的遺傳信息。慢創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日病毒包裝質(zhì)?？晒┙o全部的轉(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的全部協(xié)助蛋白。為發(fā)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達(dá)載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培育基中，離心獲得上清液后，能夠直接用于宿主細(xì)胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細(xì)胞以后，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄，整合到基因組，進(jìn)而高水平的表達(dá)效應(yīng)分子?；椿A(chǔ)理：慢病毒載系統(tǒng)統(tǒng)由兩部分構(gòu)成，即包裝成分和載體成分。包裝成分：由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而建立，能夠反式供給發(fā)患病毒顆粒所一定的蛋白。包裝成分往常被分開(kāi)建立到兩個(gè)質(zhì)粒上，一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Gag和Pol蛋白，另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。將包裝成分與載體成分的3個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞(如人腎293T細(xì)胞)，即可在細(xì)胞上清中收獲只有一次性感染能力而無(wú)復(fù)制能力的、攜帶目的基因的HIV-1載體顆粒。載體成分：與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時(shí)擁有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)拔出的目的基因。為降低兩種成分同源重組恢復(fù)成野生型病毒的可能，需盡量減少兩者的同源性，如將包裝成分上5′LTR換成巨細(xì)胞病毒(CMV)立刻初期啟動(dòng)子、3′LTR換成SV40polyA等。創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日一、實(shí)驗(yàn)流程（1和2為并列步伐）設(shè)計(jì)上下游特異性擴(kuò)增引物，同時(shí)引入酶切位點(diǎn)，PCR(采納高保真KOD酶，3K內(nèi)突變率為0%)從模板中（CDNA質(zhì)?；蛟S文庫(kù)）調(diào)取目的基因CDS區(qū)（codingsequence）連入T載體。將CDS區(qū)從載體上切下，裝入慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒載體。合成siRNA對(duì)應(yīng)的DNA頸環(huán)構(gòu)造，退火后連入慢病毒擾亂質(zhì)粒載體慢病毒載體的包裝與濃縮純化制備慢病毒穿越質(zhì)粒及其協(xié)助包裝原件載體質(zhì)粒，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素抽提，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后6h改換為完整培育基，培育24和48h后，分別采集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，病毒上清液經(jīng)過(guò)超離心濃縮病毒。二、實(shí)驗(yàn)資料2.1慢病毒載體、包裝細(xì)胞和菌株該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，構(gòu)成為pspax2,pMD2G,pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。此中質(zhì)粒上的ZsGreen1表達(dá)框能表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日創(chuàng)作時(shí)間：貳零貳壹年柒月貳叁拾日載體信息慢病毒克隆載體圖譜以下：2）包裝質(zhì)粒信息以下：PMD2G載體圖譜和序列信息PSPAX2載體圖譜和序列信息：細(xì)胞株293T，慢病毒的包裝細(xì)胞，為貼壁依靠型成上皮樣細(xì)胞，生長(zhǎng)培育基為DMEM(含10%FBS)