實時熒光定量原理及應用

實時熒光定量原理及應用第一頁，共四十六頁，2022年，8月28日主要內容熒光定量PCR原理熒光定量PCR方法與應用第二頁，共四十六頁，2022年，8月28日熒光定量PCR定義

在PCR反應體系中，加入熒光集團，利用熒光信號的累積對PCR反應過程實時監(jiān)控，最終對初始模板進行定量。第三頁，共四十六頁，2022年，8月28日傳統(tǒng)PCR定量與實時定量PCR

傳統(tǒng)的PCR定量是一種終點法的檢測：

動態(tài)范圍受限檢測重現性極差

實時定量PCR依靠熒光信號的擴增進行檢測：

靈敏度高重復性好動態(tài)范圍寬高通量第四頁，共四十六頁，2022年，8月28日Gel-basedquantification11,500counts/5200counts=2.2folddifference第五頁，共四十六頁，2022年，8月28日Real-timequantificationCt18andCt22,2^(4Ctshift)=16folddifference第六頁，共四十六頁，2022年，8月28日Ct終點檢測重復性好精確度高誤差小傳統(tǒng)PCR與實時定量PCR第七頁，共四十六頁，2022年，8月28日閾值threshold：在熒光信號指數擴增階段，在擴增曲線任意位置上人為設定的一個值，一般我們將熒光閾值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。CT=cyclethreshold即閾值循環(huán)數：熒光信號達到閾值設定值時PCR所經歷的循環(huán)數。閾值與CT值第八頁，共四十六頁，2022年，8月28日檢測極限[DNA]CycleCtCtCt閾值thresholdC(t)值與閾值第九頁，共四十六頁，2022年，8月28日熒光定量PCR原理

起始模板濃度的對數與C(t)值成反比第十頁，共四十六頁，2022年，8月28日如何定量繪制標準曲線所測樣本C(t)值定量第十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日標準曲線通過已知起始拷貝數的標準品作出的標準曲線，根據樣品的Ct值，依據Log起始拷貝量與Ct的線性關系，就可以計算出樣品中所含的模板量第十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日熒光定量PCR方法熒光染料法熒光探針法第十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日SYBRGreenI?

TaqMan?MolecularBeaconsDNAbindingProbebaseddetectionTaqTaq染料和探針第十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日SYBRGreen:最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm

染料只與雙鏈DNA小溝結合，單鏈不結合游離時熒光信號非常低，結合后熒光信號強度增強1000倍

不能區(qū)分引物二聚體，單鏈二級結構，非特異性產物需要做熔解曲線分析產物的單一性SYBRgreen是一個很好的初級化學試劑，價格上存在優(yōu)勢，在試驗驗證和問題分析上非常有用。SYBRGreen法作用機理第十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日熔解曲線分析單一峰，無非特異性產物，定量準確有雜峰，有非特異性產物，定量不準確第十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日unboundprobe

freeinsolutionLightemissionLightenergytransferTaqReporterdyeAcceptordye(Quencher)TaqLightemissionLight特點：

特異性高：只有引物和探針都和同一模板結合時才能檢測完全實時監(jiān)測：一分子熒光信號對應一條DNA鏈的產生多通道檢測：可以在一次反應中同時檢測多個不同目的基因序列Taqman探針法Taqman探針：是與目的序列互補的寡聚核苷酸，5‘端標記熒光報告集團，3’端標記熒光淬滅集團，探針完整時不發(fā)出熒光，水解后發(fā)出熒光。第十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日HCV(FAM)RNAvirus65bpampliconHIV-1(HEX)RNAVirus74bpampliconHBV(CY5)DNAvirus81bpampliconTaqman三通道實驗DanielCandotti-Cambridge,UK第十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日絕對定量相對定量SNP分析實時定量PCR應用第十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日應用之一：病原體檢測與定量絕對定量（檢測起始模板數的精確拷貝數－病原體的多少）標準品（如質粒）：做系列梯度稀釋待測樣本陰性對照（NTC）第二十頁，共四十六頁，2022年，8月28日應用之一：病原體檢測與定量1432第二十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日應用之一：病原體檢測與定量第二十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日應用之二：基因表達差異分析相對定量：基因表達量上升或者表達被抑止的倍數兩種樣品：Calibrator（對照，如正常組織）與Sample（待測樣品）兩個基因：目的基因與看家基因第二十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日Normalizer看家基因應用之二：基因表達差異分析CalibratorSampleGeneofInterest目的基因CtCtCtCtCt1Ct2第二十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日應用之二：基因表達差異分析基因表達差異＝2

/2Ct1Ct2＝2Ct1-Ct2第二十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日應用之二：基因表達差異分析RNA抽提RT定量PCRcDNA產物系列稀釋兩個基因的擴增效率第二十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日應用之二：基因表達差異分析1234第二十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日

應用之二：基因表達差異分析第二十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日兩條探針分別針對不同等位基因ACGTACGT應用之三：SNP分析第二十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日應用之三：SNP分析FAMTETFAMTET12第三十頁，共四十六頁，2022年，8月28日應用之三：SNP分析21第三十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日Thankyou！選擇吉泰，選擇成功！第三十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日試驗設計與優(yōu)化PCR是精確性很高的實驗，實驗前我們需要完整的實驗設計方案，而且實驗條件對結果影響也很大。PCR擴增效率：保證實驗的精確性和重復性。影響擴增效率的因素：擴增子長度；擴增子GC含量；擴增子、引物、探針二級結構；PCR各組分反應濃度；模板濃度。第三十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日引物設計原則擴增片段100-200bp引物長度18-30bp，Tm在58-62℃之間，上下游引物Tm值不超過2℃GC含量在30-80%，避免出現多個重復堿基，3’端不為G或C。避免引物內二級結構，引物間二聚體出現。跨外顯子設計引物，消除基因組DNA擴增第三十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日探針設計原則Taqman探針長度25-32bp，Tm在68-72℃之間，確保比引物的Tm值大5-10℃GC含量在30-80%，避免出現多個重復堿基5’端不能為G，G能淬滅熒光信號Taqman探針要靠近上游引物，最好只有一個堿基距離。避免探針與引物間形成二級結構SNP位點應設計在探針中間位置第三十五頁，共四十六頁，2022年，8月28日實時PCR體系優(yōu)化基本參數的優(yōu)化MgCl2的濃度，DNA：2-5mM;mRNA：4-8mM。模板濃度，系列稀釋梯度模板，CP在15-30之間。而CP值的確定經驗上是SYBRGreen熒光信號是本底的2倍，雜交探針熒光強度是本底的0.3倍。第三十六頁，共四十六頁，2022年，8月28日使用SYBRGreen測定DNA的優(yōu)化MgCl2的濃度，2-4mM模板濃度，DNA：50ng-5pg；質粒：106拷貝引物濃度，0.3uM退火濃度，比計算出的Tm小5℃第三十七頁，共四十六頁，2022年，8月28日使用SYBRGreen進行一步法RT-PCR的條件優(yōu)化MgCl2的濃度，4-8mM模板濃度，總RNA或mRNA：1pg-1ug第三十八頁，共四十六頁，2022年，8月28日雜交探針測定DNAMgCl2的濃度，不要超過2mM探針濃度，0.2uM第三十九頁，共四十六頁，2022年，8月28日雜交探針進行實施定量RT-PCRMgCl2的濃度，4-8mM之間探針濃度，0.2uM模板濃度設置，1pg-1ug的總RNA或是mRNA第四十頁，共四十六頁，2022年，8月28日熒光定量PCR儀的硬件條件激發(fā)光源熱循環(huán)－加熱、制冷樣品檢測設備第四十一頁，共四十六頁，2022年，8月28日熒光定量PCR儀應滿足的要求光源的光譜范圍寬廣，能激發(fā)不同的熒光染料能分開不同熒光素的激發(fā)光與發(fā)射光波長能檢測的靈敏度與動態(tài)檢測范圍準確的溫度控制和良好的孔間溫度均一性.第四十二頁，共四十六頁，2022年，8月28日

Stratagene公司成立于1984年,致力于發(fā)展生命科學領域的創(chuàng)新產品與科技.總部位于美國LaJolla,California.在歐洲與日本設有分公司.2007年被Agilent公司收購，成為Agilent公司旗下品牌。Stratagene公司簡介第四十三頁，共四十六頁，2022年，8月28日Mx3000P整體設計熱蓋熱循環(huán)系統(tǒng)石英鹵鎢燈發(fā)射光濾鏡輪激發(fā)光濾鏡輪光纖掃描臂第四十四頁，共四十六頁，2022年，8月28日儀器優(yōu)勢石英