免疫沉淀試驗

關(guān)于免疫沉淀試驗第1頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三

教學(xué)目的掌握：液相內(nèi)沉淀試驗、凝膠內(nèi)沉淀試驗原理熟悉：沉淀反應(yīng)的特點、免疫電泳技術(shù)、沉淀反應(yīng)的應(yīng)用第2頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三

一、基本原理免疫沉淀反應(yīng)（immunoprecipitationreaction）指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。第一節(jié)免疫沉淀試驗的基本原理第3頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三形成肉眼可見的大的免疫復(fù)合物。第一階段第二階段沉淀反應(yīng)分兩個階段抗原抗體特異性結(jié)合，快速但不可見第4頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三環(huán)狀沉淀試驗絮狀沉淀試驗免疫濁度測定免疫擴散試驗免疫電泳技術(shù)液體內(nèi)沉淀試驗?zāi)z內(nèi)沉淀試驗二、免疫沉淀試驗的分類第5頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三1.階段性2.特異性3.抗原性質(zhì)：可溶性4.抗體的選擇：2價

三、免疫沉淀試驗的特點第6頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)液體免疫沉淀試驗第7頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三一、絮狀免疫沉淀試驗絮狀免疫沉淀試驗是將抗原與相應(yīng)抗體混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見的絮狀沉淀物。第二節(jié)液體免疫沉淀試驗第8頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三抗原稀釋法：抗原最適比例抗體稀釋法：抗體最適比例方陣滴定法：抗原抗體最適比例一、絮狀免疫沉淀試驗第9頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三1:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀釋加入抗血清各管抗體量不變振搖混勻、37℃孵育沉淀量不同出現(xiàn)沉淀量最多的管為最適比例管。輕搖絮狀沉示意圖淀AgAbAg第10頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三最適比方陣測定法第11頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三

原理：當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時，在增濁劑中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。

二、免疫濁度測定第12頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三優(yōu)點：穩(wěn)定性好、簡便快速，易于自動化敏感度高精確度高無放射性核素污染第13頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三1.根據(jù)反應(yīng)的時間和反應(yīng)結(jié)合的動力學(xué)分為速率比濁法終點比濁法2.根據(jù)檢測儀器的位置及光信號性質(zhì)分為透射免疫比濁法散射免疫比濁法3.免疫膠乳比濁法分類：第14頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三

透射比濁試驗和散射比濁試驗光路檢測器A檢測器BIC

I0

Iθ

Iθ

透射比濁試驗

散射比濁試驗當(dāng)復(fù)合物＜3×106dal，I≈Iθ;θ＜90°，散射光的量代表IC的量。第15頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三（1）抗原抗體的比例：反應(yīng)體系保持抗體過量（2）抗體的質(zhì)量：特異性強，效價高，親和力強，并使用R型抗體（3）抗原抗體反應(yīng)液的環(huán)境：最適PH為6.5-8.5（4）增濁劑補充：免疫濁度測定影響因素第16頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三（1）抗原抗體的比例第17頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三

在抗體過量的反應(yīng)體系中,抗原量的遞增與比濁定量成正比,當(dāng)抗原抗體比例合適時反應(yīng)達(dá)峰值,而當(dāng)抗原過量時,形成的免疫復(fù)合物分子小,濁度反而下降的一個拋物曲線。海德堡曲線第18頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三（2）抗體的質(zhì)量抗體的特異性抗體的效價(>1:20)抗體的親和力R型和H型抗體（R型）第19頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三（3）抗原抗體反應(yīng)的環(huán)境最適PH為：6.5-8.5離子強度大，IC形成快離子種類的影響，常用磷酸鹽緩沖液（4）增濁劑PEG(6000—8000)濃度4%吐溫-20第20頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三1.抗血清中有非特異性的交叉反應(yīng)性雜抗體成分2.增濁劑濃度和反應(yīng)時間掌握不當(dāng)3.樣品本身的濁度處理不當(dāng)4.試劑污染變質(zhì)5.比色杯不夠清潔偽濁度形成的原因第21頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)凝膠內(nèi)免疫沉淀試驗第22頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三第三節(jié)凝膠內(nèi)免疫沉淀試驗第23頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三

可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇并且濃度比例適當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。

原理第24頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三反應(yīng)介質(zhì)：凝膠凝膠的特點：1、固相的液體2、多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)3、Ag-Ab復(fù)合物網(wǎng)絡(luò)在凝膠中第25頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三原理：抗體與待測的抗原,在兩者比例合適的部位結(jié)合形成沉淀環(huán)。環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關(guān)。技術(shù)要點：1.制板2.打孔3.加樣4.擴散

5.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線定量試驗一、單向免疫擴散試驗第26頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三抗體+瓊脂沉淀環(huán)抗原傾注平板打孔加樣放置37℃

24～48h觀察沉淀環(huán)一、單向免疫擴散試驗第27頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三第28頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三

T1為16-24h；T2為24-48h；T3為48h以上,可見T3為直線，T1為反拋物線

t1為16-24h；t2為24-48h；t3為48h以上,可見t1為直線，t3為反拋物線Mancini曲線Fahey曲線第29頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三待檢蛋白質(zhì)抗原須具備的條件僅針對某待測抗原的單價特異性抗血清已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品待測品含量在1.25g/ml以上第30頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三單向擴散試驗上排為5個不同濃度的參考品；下排為患者血清，下排右2為異常病理血清一、單向免疫擴散試驗第31頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三應(yīng)用IgG、IgA、IgM、C3、C4、轉(zhuǎn)鐵蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多種血漿蛋白的檢測第32頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三技術(shù)要點：

1.制板

2.打孔

3.加樣

4.擴散二、雙向免疫擴散試驗第33頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三第34頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三第35頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三1.判斷抗原或抗體的存在以及估計相對含量2.分析抗原或抗體相對分子量二、雙向免疫擴散試驗第36頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三3.分析抗原的性質(zhì)二、雙向免疫擴散試驗第37頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三第38頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三4.滴定抗體的效價5.鑒定抗原或抗體純度二、雙向免疫擴散試驗第39頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三

應(yīng)用

1.AFP檢測的最早方法

2.血清中含量較高的酶類、細(xì)菌病毒感染后血清中產(chǎn)生的抗體的檢測第40頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三三、免疫電泳技術(shù)第41頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三

優(yōu)點：

1.加快反應(yīng)的速度。

2.提高了靈敏度。

3.增加了分辨率。電泳分析＋沉淀反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)的高度特異性電泳技術(shù)的高分辨率、快速、微量三、免疫電泳技術(shù)第42頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三電泳（electrophoresis）：在外加電場的作用下帶電顆粒向著其電性相反的電極移動，稱為電泳。

第43頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三電泳遷移率：定義：同一電場條件下，各種帶電粒子在單位時間內(nèi)移動的距離。M=cm2/VS影響泳動的速度的因素:

本身凈電荷量、顆粒大小、形狀電場強度溶液pH值溶液離子強度電滲第44頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三電滲：電場中液體相對于固體的運動

①載體的性質(zhì)

②緩沖液的離子強度

③電泳時的電壓第45頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三電滲方向與樣品運動方向一致：樣品遷移率加快電滲方向與樣品運動方向不一致：樣品遷移率降低，甚至倒退

第46頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三電泳載體：瓊脂瓊脂糖凝膠

常用濃度：0.8%-1.0%

特點:雜質(zhì)少、接近電中性，常溫易凝固，色澤透明、質(zhì)地均勻、富有彈性。第47頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)：

--NH2

+H2O

--NH3++OH---COOH--COO-+H+

兩性離子pH=pI電中性，無電泳移動性pH<pI酸性溶液帶正離子，向陰極泳動pH>pI堿性溶液帶負(fù)離子，向陽極泳動第48頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三原理：雙向擴散+電泳實質(zhì)上是定向加速度的免疫雙擴散技術(shù)比雙向擴散試驗靈敏度提高8～16倍（一）對流免疫電泳第49頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三通電－蛋白質(zhì)抗原常帶較強的負(fù)電荷，在電場中向正極移動抗體球蛋白帶負(fù)電荷較少，籍電滲作用向負(fù)極泳動

＋（一）對流免疫電泳第50頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三第51頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三結(jié)果分析：無沉淀線出現(xiàn)則表明無相應(yīng)的抗原。沉淀線位于抗原抗體孔中間，說明兩者比例較適合。（一）對流免疫電泳第52頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三技術(shù)評價：

1.簡便、快速,敏感度較雙擴提高8-16倍，可測蛋白質(zhì)濃度達(dá)ug/ml.2.要求抗原、抗體比例嚴(yán)格3.不適宜抗原抗體都是球蛋白的檢測第53頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三

抗原抗體分子復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個形狀如火箭的不溶性復(fù)合物沉淀峰，抗體濃度固定時，峰的高度與抗原量呈正相關(guān)。

單向免疫擴散＋電泳,定量檢測技術(shù)（二）火箭免疫電泳第54頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三1.2%巴比妥瓊脂糖約55℃，加入適量抗血清，混勻后制板，打孔，孔內(nèi)加待測樣品，樣品孔放負(fù)極側(cè)，6h后觀察瓊脂板上沉淀峰，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出待測樣品濃度。技術(shù)要點（二）火箭免疫電泳第55頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三

火箭免疫電泳圖①②③④為標(biāo)準(zhǔn)抗原；⑤⑥為標(biāo)本-+（二）火箭免疫電泳示意圖第56頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三結(jié)果判定：

1、定性：直接觀察、染色2、定量：根據(jù)峰高-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算3、為提高靈敏度，可加入少量125I標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)抗原共同電泳，則可在含抗體的瓊脂中形成不可見的火箭峰第57頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三原理：區(qū)帶電泳＋雙向擴散1、將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中電泳分成肉眼不可見的若干區(qū)帶2、沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清進行雙向擴散（三）免疫電泳第58頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三根據(jù)各蛋白所處的電泳位置,可分為:白蛋白區(qū)、球蛋白區(qū)、1區(qū)、2區(qū)、區(qū)、區(qū)

+--ALB12白蛋白抗胰蛋白酶觸珠蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白IgG前白蛋白酸糖蛋白銅藍(lán)蛋白C3aC3bCRP1脂蛋白抗糜蛋白酶巨球蛋白第59頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三第60頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三第61頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三1.純化抗原和抗體成分的分析2.正常及異常免疫球蛋白的識別與鑒定應(yīng)用免疫電泳第62頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三-+（三）免疫電泳示意圖第63頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三第64頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三技術(shù)評價：

1.分辨率較高2.僅定性3.擴散時間長，影響因素多，結(jié)果較難分析4.目前大量應(yīng)用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常體液蛋白的識別與鑒定。第65頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三抗原抗體在凝膠中直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，在適當(dāng)位置形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)染色后，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進行分型原理區(qū)帶電泳＋沉淀反應(yīng)（四）免疫固定電泳第66頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三

左圖為IgGκ型,中圖為IgGλ型，右為正常

SPGAMκλSPGAMκλSPGAMκλ（四）免疫固定電泳示意圖第67頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三原理：

待檢蛋白電泳

固定劑及各類抗血清加于凝膠表面的泳道抗原與對應(yīng)抗體反應(yīng)沉淀漂洗染色某一抗原的存在?

第68頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三分辨率強，敏感度高，操作周期短，僅需數(shù)小時，結(jié)果易于分析。應(yīng)用最常用于M蛋白的鑒定與分型，也用于尿中本周氏蛋白質(zhì)的檢測與κ、λ分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢測與分型。優(yōu)點（四）免疫固定電泳第69頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三應(yīng)用:M蛋白的鑒定和分型第70頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三（五）交叉免疫電泳（六）自動化免疫電泳第71頁，共78頁，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)免疫沉淀試驗的臨床應(yīng)用

免疫濁