基因工程原理重組基因?qū)胧荏w細(xì)胞

（優(yōu)選）基因(Yin)工程原理重組基因(Yin)導(dǎo)入受體細(xì)胞第一頁(yè)，共九十五頁(yè)。DNA重組（限制性內(nèi)切酶）運(yùn)輸工具——基因克隆載體目的基因的制備目的基因?qū)?Ru)受體細(xì)胞外源基因的表達(dá)基因工程的應(yīng)用第二頁(yè)，共九十五頁(yè)。第五章重組基因?qū)?Ru)受體細(xì)胞第三頁(yè)，共九十五頁(yè)。第一節(jié)(Jie)受體細(xì)胞受體細(xì)胞（receptorcell），又稱宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞，是能夠攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞。受體細(xì)胞的選擇應(yīng)符合以下原則：①便于重組DNA分子的導(dǎo)入②能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中③便于重組體的篩選④遺傳穩(wěn)定性高⑤安全性高⑥內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低⑦遺傳密碼無(wú)明顯偏倚性⑧具有較好的轉(zhuǎn)移后加工機(jī)制第四頁(yè)，共九十五頁(yè)。1.原核受體細(xì)胞較為理想的受體細(xì)胞：大部分沒(méi)有細(xì)胞壁，便于外源DNA進(jìn)入沒(méi)有核膜，染色體DNA沒(méi)有固定結(jié)合(He)的蛋白質(zhì)基因組簡(jiǎn)單，不含線粒體、質(zhì)體多為單細(xì)胞，容易獲得一致性材料，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長(zhǎng)常用細(xì)菌：大腸桿菌。第五頁(yè)，共九十五頁(yè)。大腸桿(Gan)菌。特點(diǎn)：G-,單個(gè)細(xì)胞，0.5μm*(1~3)μm，周身鞭毛、能運(yùn)動(dòng)、無(wú)芽孢。例：胰島素、生長(zhǎng)素、干擾素、RE……優(yōu)點(diǎn)：完善成熟的受體系統(tǒng)。缺點(diǎn)：毒素等，折疊加工問(wèn)題第六頁(yè)，共九十五頁(yè)。酵母菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)：結(jié)構(gòu)最為簡(jiǎn)單的真核生物之一，基(Ji)因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡(jiǎn)單培養(yǎng)簡(jiǎn)單遺傳穩(wěn)定性高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長(zhǎng)安全性高，無(wú)致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成污染具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制，便于真核生物表達(dá)2.酵母受體細(xì)胞第七頁(yè)，共九十五頁(yè)。3.植物受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：真核細(xì)胞、細(xì)胞的全能性。4.動(dòng)物細(xì)胞受體細(xì)胞包括：小鼠BHK細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chao)細(xì)胞CHO，猴腎細(xì)胞等受體動(dòng)物：鼠、牛、羊、魚(yú)等第八頁(yè)，共九十五頁(yè)。第二節(jié)重組基因?qū)?Ru)受體細(xì)胞一、重組基因?qū)朐耸荏w細(xì)胞接受DNA片段第九頁(yè)，共九十五頁(yè)。轉(zhuǎn)化（transformation）——重組質(zhì)粒DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞，并(Bing)在受體細(xì)胞穩(wěn)定維持和表達(dá)的過(guò)程，轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱轉(zhuǎn)化子。（一）轉(zhuǎn)化1928年英國(guó)學(xué)者F·Griffth在肺炎雙球菌中發(fā)現(xiàn)的，證明了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA。轉(zhuǎn)化率＝轉(zhuǎn)化子DNA分子數(shù)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞數(shù)＝第十頁(yè)，共九十五頁(yè)。Ca2+誘(You)導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的菌體5x107個(gè)/毫升冰浴10分鐘含CaCl2緩沖液15分鐘含CaCl2緩沖液（1）感受態(tài)的制備（2）DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（3）篩選轉(zhuǎn)化子。Ca2+：低溫下使磷質(zhì)層形成液晶結(jié)構(gòu)，使膜間核酸酶分離與DNA結(jié)合，抗DNase第十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。（二(Er)）轉(zhuǎn)導(dǎo)是指通過(guò)λ噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細(xì)胞將外源DNA分子導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)并穩(wěn)定遺傳的過(guò)程。第十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。D突變E突變?nèi)茉淳囵B(yǎng)誘導(dǎo)溶菌生長(zhǎng)45℃15min39℃2-3h收集包裝物λ噬菌體DNA噬菌體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝第十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。（三）轉(zhuǎn)(Zhuan)染是采用與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞相似的方法，將重組λ噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過(guò)程。第十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。（四）電(Dian)激穿孔是利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的有效吸收?！?988年，DowerWJ等參數(shù)：電場(chǎng)強(qiáng)度電脈沖時(shí)間外源DNA濃度當(dāng)50%～70%菌體細(xì)胞死亡時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高第十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。（五）三親本雜(Za)交（triparentalmating）三親本雜交結(jié)合轉(zhuǎn)化法是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用而建立的一種DNA轉(zhuǎn)化方法。第十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。第十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。二、重組基因?qū)?Ru)植物受體細(xì)胞（一）土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化外植體：植物組織培養(yǎng)中作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片段。在繼代培養(yǎng)時(shí)，將培養(yǎng)的組織切段移入新的培養(yǎng)基時(shí)，這種切段也稱外植體。將目的基因插入到經(jīng)過(guò)改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。第十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。（Vir區(qū)）（Con區(qū)）長(zhǎng)度25kb，占Ti質(zhì)粒1/10主要功能是轉(zhuǎn)移(Yi)DNA，隨機(jī)插入植物染色體中?！烊坏馁|(zhì)?？寺≥d體。含有2類(lèi)基因：（1）編碼冠癭堿合成酶（ocs、nos）及分解代謝的基因。（2）誘發(fā)腫瘤基因（Onc）Vir區(qū)：激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性。占Ti質(zhì)粒1/3。Con區(qū)——調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移，含有與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因tra。Ori區(qū)——復(fù)制起始區(qū)。第十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。限制性酶切開(kāi)外源基因Ti質(zhì)粒載體第二十頁(yè)，共九十五頁(yè)。（1）葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化植物(Wu)細(xì)胞第二十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。（2）整體植株(Zhu)接種轉(zhuǎn)化法人為地在整體植株上造成創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷表面，使農(nóng)桿菌按照天然的感染過(guò)程在植株體內(nèi)進(jìn)行侵染。獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。第二十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。（3）原(Yuan)生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法是以原生質(zhì)體作為受體細(xì)胞，通過(guò)將根癌農(nóng)桿菌與原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，然后洗滌除去殘留的根癌農(nóng)桿菌后，置于含抗生素的選擇培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞，進(jìn)而再生成植株。第二十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。（4）懸(Xuan)浮細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法與原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法相似第二十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。（二）植物病毒介(Jie)導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移植物病毒DNA病毒20%RNA病毒80%花椰菜花葉病毒：雙鏈DNA病毒第二十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。（三）化學(xué)誘導(dǎo)(Dao)DNA直接轉(zhuǎn)化（1）多聚物介導(dǎo)法聚乙二醇多聚賴氨酸多聚鳥(niǎo)苷酸第二十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。（2）脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)(Zhuan)化脂質(zhì)體第二十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。第二十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。（四）物理方法介導(dǎo)DNA直(Zhi)接轉(zhuǎn)化（1）基因槍轉(zhuǎn)化第二十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。（2）超(Chao)聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（3）激光微束穿孔轉(zhuǎn)化第三十頁(yè)，共九十五頁(yè)。（4）顯微注(Zhu)射第三十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。第三十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。三、重組基因?qū)?Ru)動(dòng)物受體細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)染法第三十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。（二(Er)）脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化第三十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。（三）動(dòng)物病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)(Zhuan)導(dǎo)法第三十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。第三節(jié)重組子篩(Shai)選只有少數(shù)受體細(xì)胞能被導(dǎo)入重組DNA分子例：大腸桿菌108個(gè)大腸桿菌，轉(zhuǎn)化效率10-6只有100個(gè)細(xì)胞被轉(zhuǎn)化第三十六頁(yè)，共九十五頁(yè)?？寺∽拥?De)篩選：經(jīng)過(guò)各種方法將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后，獲得所需陽(yáng)性克隆子的過(guò)程稱為克隆子的篩選（Screening）或選擇(Selection)。轉(zhuǎn)化子：導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞。重組子：含有重組DNA分子的轉(zhuǎn)化子。如果重組子含有外源目的基因，又稱為陽(yáng)性克隆子或期望重組子。第三十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。一、遺傳(Chuan)表型直接篩選（一）利用載體選擇性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子抗藥性標(biāo)插入失活篩選插入表達(dá)篩選α－互補(bǔ)法（藍(lán)白斑篩選法）（二）利用報(bào)告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞（三）利用遺傳選擇標(biāo)記篩選哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞（四）營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢測(cè)法（五）形成噬菌斑篩選法第三十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。二、依賴于重(Zhong)組子結(jié)構(gòu)特征分析篩選三、核酸雜交分析（一）分子探針：放射性探針、非放射性探針、標(biāo)記探針的方法（二）核酸探針雜交分析四、免疫化學(xué)分析檢測(cè)（一）抗體檢測(cè)法（二）免疫沉淀測(cè)定法（Immunoprecipitation,IP）（三）轉(zhuǎn)譯篩選法五、PCR篩選法第三十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。一、遺(Yi)傳表型直接篩選（一）利用載體選擇性標(biāo)記篩選轉(zhuǎn)化子1.抗藥性標(biāo)記氨芐青霉素氯霉素卡那霉素四環(huán)素鏈霉素第四十頁(yè)，共九十五頁(yè)。2.插入失(Shi)活篩選第四十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。3.插入表達(dá)(Da)篩選載體的選擇性標(biāo)記基因前鏈接一段附調(diào)控序列，插入式禍福調(diào)控序列后，其下游的篩選標(biāo)記基因才能表達(dá)第四十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。。IPTG：異丙基-β-D-硫代半乳(Ru)糖苷4.α－互補(bǔ)法（藍(lán)白斑篩選法）乳糖操縱子：第四十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。第四十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。IPTGα-互補(bǔ)：是指lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶陰性(Xing)的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)。第四十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。IPTG：異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷顯(Xian)色劑：X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，在β-半乳糖苷酶的催化下會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。第四十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。第四十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。（二）利用報(bào)告基因篩選植物(Wu)轉(zhuǎn)化細(xì)胞（1）新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPTⅡ）基因（2）潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPT）基因（3）氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶（CAT）基因（4）β—葡萄糖苷酶（GUS）基因（5）熒光素酶（LUC）基因（6）抗除草劑bar基因：抗草丁膦（7）冠癭堿合成酶基因報(bào)告基因(reportergene)——是一種編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說(shuō)，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來(lái)標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。第四十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。熒光素酶（LUC）基(Ji)因轉(zhuǎn)入了螢火蟲(chóng)的熒光素酶基因能發(fā)光的煙草(1)螢光素+ATP→螢光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+PPi(2)螢光素化腺苷酸+O2→氧螢光素+AMP+光機(jī)理：第四十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。GFP：綠色熒(Ying)光蛋白日本科學(xué)家下村修（伍茲霍爾海洋生物學(xué)研究所）美國(guó)科學(xué)家馬丁?查爾菲（哥倫比亞大學(xué)）錢(qián)永健（加利福尼亞大學(xué)圣迭戈分校）2008年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)：第五十頁(yè)，共九十五頁(yè)。GFP標(biāo)記(Ji)的微管將綠黃紅熒光蛋白質(zhì)植入魚(yú)的DNA分子結(jié)構(gòu)中穩(wěn)定表達(dá)表達(dá)GFP的CHO細(xì)胞GFP轉(zhuǎn)基因小鼠第五十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。（三）利用遺傳選擇標(biāo)記篩選哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)(Zhuan)基因細(xì)胞（1）胸苷激酶（TK）基因：（2）二氫葉酸還原酶（DHFR）基因（3）黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因：胸苷（T）轉(zhuǎn)換成TMP的基因催化二氫葉酸還原成四氫葉酸催化GMP生成第五十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。（四）營(yíng)養(yǎng)缺陷型檢(Jian)測(cè)法第五十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。（五）形成(Cheng)噬菌斑篩選法第五十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。二、依賴于重組子(Zi)結(jié)構(gòu)特征分析篩選（一）快速裂解菌落鑒定分子大小：瓊脂糖電泳，分析DNA分子大?。ǘ┫拗菩院怂醿?nèi)切酶酶解分析：DNA酶切圖譜（三）核酸雜交分析第五十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。三、核酸雜(Za)交分析基本原理：具有一定互補(bǔ)的兩條核酸(DNA或RNA)單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下，可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則高度特異地復(fù)性形成雙鏈。核酸雜交：兩種不同來(lái)源單鏈DNA或RNA相互配對(duì)的過(guò)程。分子雜交：生物大分子之間通過(guò)相互作用結(jié)合在一起：核酸之間通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)；蛋白質(zhì)之間通過(guò)抗原、抗體反應(yīng)；核酸、蛋白質(zhì)之間通過(guò)疏水作用，氫鍵進(jìn)行相互作用?！?968年華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院RoyBritten等第五十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。常見(jiàn)的分子雜(Za)交：Southernblotting：DNA，DNA/RNA

Northernblotting：RNA，DNA/RNA

Dot/slotblotting（斑點(diǎn)/狹縫雜交）insituhybridization：組織原位雜交Westernblotting：蛋白質(zhì)/抗原、抗體待測(cè)分子探針第五十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。（一(Yi)）分子探針(Molecularprobe)：是指具有同特異性目標(biāo)分子產(chǎn)生很強(qiáng)的相互作用并可對(duì)其相互作用的產(chǎn)物進(jìn)行有效檢測(cè)的DNA分子、RNA分子和蛋白質(zhì)。1.放射性探針：32P、3H、35S、14C、125I第五十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。2.非放射性(Xing)探針（1）生物素（biotin）標(biāo)記探針：生物素與dUTP中尿嘧啶的5位C相連，在聚合酶作用參入DNAdUTPBiotin(維生素H，VH)連接臂第五十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。（藻(Zao)紅素）（鏈霉親和素）（生物素）第六十頁(yè)，共九十五頁(yè)。（2）

地高辛標(biāo)記探針(Zhen)：地高辛與UTP中尿嘧啶的C5相連dUTP連接臂地高辛地高辛：異羥基洋地黃毒苷，強(qiáng)心素，拉諾辛，Cardiox，Cardoxin，Cedoxin第六十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。第六十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。第六十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。（3）

熒光(Guang)素標(biāo)記探針：用熒光素標(biāo)記核酸、抗生物素蛋白或抗地高辛抗體。

熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素（黃綠色）羅丹明（紅色）羥基香豆素（蘭色）第六十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。3.標(biāo)記探針(Zhen)的方法（1）切口平移標(biāo)記法第六十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。（2）隨(Sui)機(jī)引物標(biāo)記法第六十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。（3）末端標(biāo)(Biao)記法第六十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。（4）PCR標(biāo)記(Ji)法第六十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。（5）光敏(Min)標(biāo)記法：光敏基團(tuán)第六十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。（6）化學(xué)衍生結(jié)合標(biāo)記法：（7）交叉(Cha)相連標(biāo)記法：第七十頁(yè)，共九十五頁(yè)。對(duì)重組體克隆進(jìn)行篩選和鑒定的方法之一是利用核酸雜交法進(jìn)行篩選，它包括Southern印記雜交法、Northern印記雜交、斑點(diǎn)印記雜交和（菌落原位雜交）雜交。各種雜交中需要對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記，其中對(duì)探針進(jìn)行非放射性標(biāo)記的常見(jiàn)標(biāo)記物有（熒光素）、（生物素）、（地高辛）。標(biāo)記探針的方法（切口平移標(biāo)記法）、（隨機(jī)引物標(biāo)記法）、（末端標(biāo)記法）、（PCR標(biāo)記法）、（光敏標(biāo)記法）、化學(xué)衍生結(jié)合標(biāo)記法以及交叉相(Xiang)連標(biāo)記法。在利用lacZ失活的顯色反應(yīng)篩選法中，IPTG的作用是(a)(a)誘導(dǎo)宿主的α肽的合成(b)誘導(dǎo)宿主的ω肽的合成(c)作為酶的作用底物(d)作為顯色反應(yīng)的指示劑第七十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。α-互補(bǔ)篩選屬于下列哪種篩選方法：(B)A.抗藥性標(biāo)志選擇B.標(biāo)志補(bǔ)救C.原位雜交法D.酶聯(lián)免疫吸附E.分子雜交應(yīng)用α-互補(bǔ)篩選重組體時(shí)，含有外源基因的重組體菌落顏色應(yīng)為：(C)A.紫色B.藍(lán)色C.白色（阻遏蛋白不能表達(dá)）D.無(wú)色E.以上都不是水母發(fā)光蛋白由236個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中Asp、Gly、Ser構(gòu)成發(fā)光環(huán)，現(xiàn)已將這種蛋白質(zhì)的基因作為生物轉(zhuǎn)基因的標(biāo)記(Ji)，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，這種蛋白質(zhì)的作用是（篩選標(biāo)記(Ji)）(C)A.促使目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中B.促使目的基因在宿主細(xì)胞中復(fù)制C.使目的基因容易被檢測(cè)出來(lái)D.使目的基因容易成功表達(dá)建立了一個(gè)基因文庫(kù)后，如何鑒定一個(gè)攜帶目的基因的克隆?第七十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。（二）核酸探針雜(Za)交分析基本原理：具有一定同源性的兩條核酸（DNA或RNA）單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下，可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則高度特異地退火形成雙鏈。探針：用于檢測(cè)的核苷酸片段。Southernblotting：DNA/DNA,RNA

Northernblotting：RNA/DNA,RNA

Dotblotting：DNA芯片insituhybridization：組織原位雜交Westernblotting：蛋白質(zhì)/抗原、抗體第七十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。第七十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。（1）Southern印跡雜交

1975年由(You)英國(guó)人southern創(chuàng)建待測(cè)的核酸序列：DNA探針：DNA或RNA第七十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。電(Dian)轉(zhuǎn)移方法：濕式電轉(zhuǎn)移半干式電轉(zhuǎn)移第七十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。（2）Nouthern印跡雜交（1979年(Nian)，J.C.Alwine等）待測(cè)的核酸序列：RNA探針：DNA或RNA第七十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。（3）斑點(diǎn)印(Yin)跡雜交和狹線印(Yin)跡雜交待測(cè)的核酸序列：DNA和RNA探針：DNA或RNA第七十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。（4）菌(Jun)落（噬菌(Jun)斑）原位雜交

Grunstein和Hosness，1975年第七十九頁(yè)，共九十五頁(yè)。第八十頁(yè)，共九十五頁(yè)。（5）熒光(Guang)原位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH）用特定熒光素如生物素、地高辛等標(biāo)記探針，與靶DNA進(jìn)行雜交，通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)過(guò)程連接上熒光素標(biāo)記物，在熒光顯微鏡下觀察探針標(biāo)記或位點(diǎn)的技術(shù)。實(shí)驗(yàn)流程：FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→（染色體顯帶）→熒光顯微鏡檢測(cè)→結(jié)果分析。第八十一頁(yè)，共九十五頁(yè)。

組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）簡(jiǎn)稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交。是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與(Yu)DNA或RNA雜交，因此原位雜交可以確定探針互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置。（6）組織細(xì)胞的原位雜交第八十二頁(yè)，共九十五頁(yè)。（7）影響探針(Zhen)雜交的因素探針?lè)肿优c目標(biāo)分子之間序列的同一性探針的長(zhǎng)度：<500b探針濃度雜交加速劑：硫酸葡聚糖雜交漂洗液的組成、反應(yīng)溫度、鹽濃度第八十三頁(yè)，共九十五頁(yè)。四、免疫化學(xué)分析檢(Jian)測(cè)待測(cè)物：蛋白質(zhì)探針：抗原、抗體抗體測(cè)定法免疫沉淀法分類(lèi)第八十四頁(yè)，共九十五頁(yè)。（一）抗體檢測(cè)(Ce)法放射性抗體測(cè)定法非放射性抗體測(cè)定法分類(lèi)第八十五頁(yè)，共九十五頁(yè)。1.放射性(Xing)抗體測(cè)定Broome和Gilbert,1978年第八十六頁(yè)，共九十五頁(yè)。2.非(Fei)放射性抗體測(cè)定第八十七頁(yè)，共九十五頁(yè)。第八十八頁(yè)，共九十五頁(yè)。（二(Er)）免疫沉淀測(cè)定法（Immunoprecipitation,IP）是一種研究蛋白質(zhì)間交互作用的生物技術(shù)，這種技術(shù)是將蛋白