白紋伊蚊越冬狀態(tài)的卵Hsp70的表達情況分析,昆蟲學(xué)論文

白紋伊蚊越冬狀態(tài)的卵Hsp70的表達情況分析,昆蟲學(xué)論文白紋伊蚊〔Aedesalbopictus〕是一種重要的醫(yī)學(xué)媒介昆蟲，在我們國家分布范圍很廣，是傳播登革熱和登革出血熱的重要媒介。作為一種變溫動物，溫度變化是造成白紋伊蚊種群季節(jié)消長的基本原因之一，耐受低溫能力的高低是其種群存在與發(fā)展的重要前提，決定著它們的生殖、擴散、分布以及下一季節(jié)的發(fā)生動態(tài)。在種群向高緯度擴散的例子中，最冷月份或季度的最低溫度和平均溫度往往被以為是白紋伊蚊分布的生態(tài)學(xué)限制因素。在這種情況下，滯育卵的產(chǎn)生能提高其在溫帶地區(qū)冬季的存活率，有助于白紋伊蚊種群的向北擴散，是白紋伊蚊越冬的重要策略。實驗室及野外實驗均證實滯育能加強白紋伊蚊對低溫的耐受能力。熱休克蛋白〔heatshockprotein，HSPs〕是細(xì)胞或生物體遭到熱脅迫后，體內(nèi)新合成或含量增加的一類遺傳上高度保守的蛋白質(zhì)，在原核生物和真核生物中普遍存在。低溫暴露導(dǎo)致熱休克蛋白70基因〔Hsp70〕mRNA表示出的上調(diào)在果蠅〔Drosophilamelanogaster〕及其他昆蟲中已有報道，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)昆蟲在滯育期間，Hsp70mRNA表示出量增加。對于冬季滯育的昆蟲，Hsp70的上調(diào)表示出對于越冬個體的存活特別重要，是提高昆蟲越冬抗寒性的重要因子。本研究通過模擬白紋伊蚊越冬狀態(tài)的卵，研究Hsp70的表示出情況，以便分析白紋伊蚊越冬卵的抗低溫能力及Hsp70在華而不實發(fā)揮的作用。1材料與方式方法1.1實驗種群及飼養(yǎng)方式方法1.1.1種群來源白紋伊蚊實驗種群，2020年采自北京市昌平區(qū)，經(jīng)多代飼養(yǎng)繁衍，已到達正常群體的自然繁衍水平。1.1.2飼養(yǎng)條件溫度〔271〕℃，相對濕度〔805〕%，光照周期〔L∶D〕＝16h∶8h。使用脫氯自來水，幼蟲飼料用羊肝粉和饅頭粉按1∶1混合而成；成蚊飼養(yǎng)用10%的蔗糖溶液及飼喂小白鼠血。1.1.3非滯育卵的獲得將蛹轉(zhuǎn)移到溫度〔211〕℃，相對濕度〔805〕%，光照周期〔L∶D〕＝16h∶8h的氣候模擬室，成蚊羽化7～10d后進食血餐，3～4d后搜集產(chǎn)下的非滯育卵，保存在一樣條件下6d后完成胚胎發(fā)育。1.1.4滯育卵的獲得將蛹轉(zhuǎn)移到溫度〔211〕℃，相對濕度〔805〕%，光照周期〔L∶D〕＝8h∶16h的氣候模擬室，成蚊羽化7～12d后進食血餐，3～4d后搜集產(chǎn)下的滯育卵，保存在一樣條件下6d后完成胚胎發(fā)育。1.2實驗方式方法1.2.1冷暴露處理將滯育卵在-7℃處理2h后，室溫25℃分別恢復(fù)1、2、3、5、7、9h后，凍存于-80℃?zhèn)溆?，每個處理重復(fù)3次，以不接受低溫處理的卵為對照。非滯育卵的處理方式方法與滯育卵一樣。1.2.2總RNA的提取與第一鏈cDNA的合成取白紋伊蚊卵，采用RNAeasyMiniKits〔購自Qiagen公司〕試劑盒提取總RNA。利用紫外分光光度計NanoDropND-1000Spectrophotometer〔NanoDropTechnologies，USA〕檢測其純度及濃度，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完好性。取1g總RNA為模板，應(yīng)用PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒〔購自TaKaRa公司〕，合成第一鏈cDNA。1.2.3引物、探針的設(shè)計根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公開發(fā)表的基因序列，設(shè)計Hsp70和內(nèi)參基因actin的引物和探針〔由北京天一輝遠(yuǎn)公司合成〕，見表1。【表1】1.2.4擴增效率一致性檢測將合成的cDNA以3倍倍比稀釋5個濃度梯度，各取1l進行實時熒光定量PCR〔RTqPCR〕反響，檢測目的基因和內(nèi)參基因的擴增效率能否一致。1.2.5實時定量PCR檢測采用RTqPCR結(jié)合比擬Ct值法對白紋伊蚊卵Hsp70表示出進行相對定量分析；采用actin作為內(nèi)參基因，分析Hsp70表示出的相對變化。RTqPCR反響根據(jù)熒光定量試劑盒GoTaqProbeqPCRMasterMix〔購自Promege公司〕的講明，采用20l的反響體系：GoTaqProbeqPCRMasterMix〔2〕10l，上、下游引物〔10mol/L〕各1l，探針〔10mol/L〕0.5l，1l稀釋10倍的cDNA作為模板，加超純水至總體積20l。在CFX96實時定量PCR儀〔BioRad公司〕上進行RTqPCR檢測，主要反響條件：95℃預(yù)變性2min；95℃變性3s，60℃退火/延伸30s，40個循環(huán)。每個循環(huán)在60℃時檢測熒光強度。1.3數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進行t檢驗及單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1RNA質(zhì)量控制經(jīng)過分光光度計檢測，提取的總RNAA260/A280均在1.8～2.0之間。使用1%瓊脂糖凝膠進行RNA電泳，28S、18S、5S條帶清楚明晰，提取的RNA符合實驗要求，可用于下一步cDNA的合成。2.2擴增效率一致性白紋伊蚊卵cDNA以3倍倍比稀釋5個濃度梯度，假定最初模板濃度為243，則其他梯度稀釋的樣品濃度可依次認(rèn)定為：81、27、9和3。以初始濃度的對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，Ct值作為縱坐標(biāo)建立RTqPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線〔圖1〕。Hsp70和actin標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9985和0.9962，講明線性關(guān)系良好。兩標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率分別為-3.3235和-3.2163，擴增效率分別為99.93%和104.61%，符合95%＜E＜105%的范圍，講明Hsp70和actin的擴增效率基本一致，能夠利用2-Ct公式進行實驗結(jié)果分析。2.3Hsp70的表示出.【圖1】2.3.1滯育卵Hsp70的表示出未經(jīng)其他處理的滯育卵與非滯育卵Hsp70的表示出，差異無統(tǒng)計學(xué)意義〔P＝0.392〕〔表2〕，表示清楚在滯育期間，白紋伊蚊卵Hsp70表示出未發(fā)生明顯變化?！颈?】2.3.2冷暴露處理后Hsp70的表示出滯育卵暴露在-7℃2h后，在25℃室溫下，隨著恢復(fù)時間的增加，Hsp70的mRNA表示出量明顯上調(diào)，在3h時到達最高水平，隨后逐步下降〔圖2〕。將恢復(fù)3h時白紋伊蚊滯育卵與非滯育卵Hsp70mRNA的表示出量進行比擬〔圖3〕，滯育卵與非滯育卵Hsp70mRNA的表示出量分別是對照組的16.44和5.22倍，滯育卵在經(jīng)過同樣的低溫處理和恢復(fù)經(jīng)過后，Hsp70mRNA的表示出量顯著高于非滯育卵的表示出量，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔P＜0.05〕。【圖2-3】3討論盡管熱休克蛋白是在高溫脅迫研究中發(fā)現(xiàn)的，但是在低溫、氨基酸類似物、低氧、高鹽、重金屬離子、營養(yǎng)饑餓、紫外線、胞外pH值變化等脅迫環(huán)境下，同樣會有熱休克蛋白的生成，最大限度地降低脅迫對機體細(xì)胞的損傷。除此之外研究還發(fā)現(xiàn)，一些昆蟲在滯育期間Hsp70表達上調(diào)。胚胎滯育的舞毒蛾〔Lymantriadiaper〕和家蠶〔Bombyxmori〕的Hsp70表示出量顯著高于它們的非滯育蟲期。麻蠅〔Sarcophagacrassipalpis〕、苜蓿切葉蜂〔Megachilerotundata〕、美國核桃實蠅〔Rhagoletissuavis〕和煙草天蛾〔Manducasexta〕滯育蛹中Hsp70表示出量均明顯高于非滯育蛹。除此之外在歐洲玉米螟〔Ostrinianubilalis〕滯育幼蟲和科羅拉多馬鈴薯甲蟲〔Leptinotarsadecemlineata〕滯育成蟲中也發(fā)現(xiàn)有類似Hsp70表示出上調(diào)的現(xiàn)象。然而不是所有的昆蟲在滯育期均上調(diào)表示出Hsp70。在絲光綠蠅〔Luciliasericata〕的滯育幼蟲中，Hsp70表示出量在滯育期間無變化。以成蟲滯育越冬的叔白顏果蠅〔Drosophilatriauraria〕和淡色庫蚊〔Culexpipiens〕，滯育期間Hsp70表示出量在滯育成蟲與非滯育成蟲之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究同樣發(fā)現(xiàn)白紋伊蚊的滯育卵與非滯育卵相比Hsp70的表示出差異無統(tǒng)計學(xué)意義。固然Hsp70在白紋伊蚊滯育期并沒有上調(diào)表示出，但是在滯育期間受冷刺激〔-7℃，2h〕后能迅速增加表示出，講明冷暴露誘導(dǎo)的Hsp70表示出并不受滯育狀態(tài)的影響。這種情況在淡色庫蚊滯育成蟲、棉鈴蟲〔Helicoverpazea〕的滯育蛹中也存在。在同樣的冷暴露條件下，白紋伊蚊滯育卵Hsp70表示出量比非滯育卵的高，而且白紋伊蚊是以滯育卵越冬的，所以我們揣測在滯育期間低溫誘導(dǎo)表示出的Hsp70有助于加強白紋伊蚊卵的耐寒性。以下為參考文獻［1］吳家紅，程金芝，陳璐，等.白紋伊蚊actin基因?qū)崟r熒光定量RTPCR方式方法的建立［J］.四川動物，2018，29〔5〕：593-595.［2］McdonaldJR，HeadJ，BaleJS，etal.Coldtolerance，overwinteringandestablishmentpotentialofThripspalmi［J］.PhysiolEntomol，2000，25〔2〕：159-166.［3］HansonSM，CralgGBJr.Aedesalbopictus〔Diptera：Culicidae〕eggs：fieldsurvivorshipduringnorthernIndianawinters［J］.JMedEntomol，1995，32〔5〕：599-604.［4］ReynoldsJA，PoelchauMF，RahmanZ，etal.Transcriptprofilingrevealsmechanismsforlipidconservationduringdiapauseinthemosquito，Aedesalbopictus［J］.JInsectPhysiol，2020，58〔7〕：966-973.［5］HansonSM，Cra