桿菌肽在水產(chǎn)品中殘留量測定的微生物方法,微生物論文

桿菌肽在水產(chǎn)品中殘留量測定的微生物方法,微生物論文桿菌肽最早于1943年由美國哥倫比亞大學(xué)的Johnson從患者的脛骨創(chuàng)傷污染物中分離出的枯草桿菌〔Bacillssabtilis〕中發(fā)現(xiàn)的[1].它是一種多組分的多肽類抗生素，含有至少5種單獨的化學(xué)成分，主要成分為桿菌肽A和桿菌肽B,對革蘭氏陽性菌的抗菌作用很強，對于螺旋體、放線菌也有同樣作用[2].當(dāng)下桿菌肽〔鋅桿菌肽和亞甲基水楊酸桿菌肽〕在很多動物中常作為飼料添加劑使用[3-5],研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加抗菌肽對吉富羅非魚具有明顯的促生長效果[6].抗菌肽還對水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)過中常見病原菌-嗜水氣單胞菌、梅氏弧菌、遲鈍愛德華氏菌及溫和氣單胞菌均有較好的抑菌效果[7].但是假如使用得不科學(xué)，將導(dǎo)致藥物在水產(chǎn)品中殘留情況嚴重，對動物性食品安全帶來隱患，因而，需要有效的檢測方式方法來檢測其殘留量。當(dāng)下動物性食品或者飼料中桿菌肽殘留量的測定方式方法主要有微生物法[8-9]、液相色譜法或色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[10-13].由于桿菌肽當(dāng)下沒有純品，需檢測的標(biāo)示物組分多，色譜和質(zhì)譜不能準(zhǔn)確地確定其全部殘留標(biāo)示物，加上需反映出不同活性組分生物活性的差異，所以采用微生物法來測定其殘留情況。本研究擬建立一種桿菌肽在水產(chǎn)品可食性組織中殘留量測定的微生物方式方法，監(jiān)測水產(chǎn)品可食性組織中桿菌肽的殘留量，以保證我們國家水產(chǎn)品中桿菌肽殘留到達安全限量。1材料與方式方法1.1材料1〕儀器與器皿。恒溫培養(yǎng)箱〔DN0-9162BS-Ⅲ,新苗醫(yī)療器械公司〕、超凈工作臺〔TypeA2,LA-BONCO〕、壓力蒸汽滅菌鍋〔BL-50A,博訊實業(yè)有限公司〕、高速冷凍離心機〔CR-21,himac〕、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀〔TRE2000E,予華儀器有限責(zé)任公司〕、旋渦混合器〔HQ-60-Ⅱ,北方同正〕、振蕩器〔SHZ-82,科興儀器廠〕、超聲波清洗器〔SK2210HP,上?？茖?dǎo)〕、電子天平〔MP2002,舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司〕，不銹鋼牛津杯〔高〔10.00.1〕mm,外徑〔8.00.1〕mm,內(nèi)徑〔6.00.1〕mm〕、游標(biāo)卡尺〔精到準(zhǔn)確度0.02mm〕、一次性培養(yǎng)皿〔15mm90mm〕等。2〕藥物與試劑。桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品〔含量76.0%,Dr.Ehrenstorfera〕、其他藥物〔硫酸鏈霉素、鹽酸土霉素、恩諾沙星、磺胺二甲嘧啶、氨卡青霉素、替米考星、乙酰甲喹、甲砜霉素〕均為標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇、甲酸、正己烷均為分析純，蒸餾水，1%pH6.0磷酸鹽緩沖液〔PBS〕：磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g,加水定容至1000mL,滅菌。3〕細菌與培養(yǎng)基。藤黃微球菌CMCC〔B〕28001-8a3、大腸桿菌CMCC〔B〕44109-9、枯草芽胞桿菌CMCC63501-2a16均購自中國獸藥監(jiān)察所，抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號〔低pH〕、LB瓊脂培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基均購自海博生物技術(shù)有限公司。4〕空白水產(chǎn)樣品。草魚、鰻鱺和對蝦購自本地水產(chǎn)品市場，檢測均無任何藥物殘留。1.2方式方法1〕標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。準(zhǔn)確稱取0.0100g〔精到準(zhǔn)確至0.0001g〕桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品，用PBS溶解并定容至100mL,制得100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃避光儲存，不超過1個月。根據(jù)需要稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，即用即配。2〕菌種培養(yǎng)及菌液制備。選用藤黃微球菌為檢測菌種。將滅過菌的LB培養(yǎng)基參加菌種安瓿瓶，溶解后，取少量到LB培養(yǎng)基中，混勻，〔361〕℃培養(yǎng)24h,之后轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)16~18h,挑取少量菌落到LB培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)24h,接種于LB瓊脂平皿中，培養(yǎng)24h,用生理鹽水洗下，調(diào)整至6108cfu/mL〔麥?zhǔn)蠞岫?.0〕備用。4℃保存不超過1周。3〕檢定平板的制備。冷卻滅過菌的抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅱ號至50~55℃,加適量檢測菌液，混勻，取5mL至培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固。用1g/mL桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)工作液預(yù)測試該菌液濃度的平板，假如培養(yǎng)后所呈現(xiàn)的抑菌圈直徑大于10mm,則該菌液濃度下的平板可使用，否則需重新調(diào)整菌液濃度，再制成能有效檢定藥物的平板。4〕空白組織液制備。稱取10g空白勻漿好的水產(chǎn)品肌肉組織于50mL離心管中，加20mLPBS,置于振蕩器中中速振蕩30min,超聲10min,8000r/min離心5min,分離的上清液用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至6.0后，用0.22m針頭式濾器除菌備用。5〕標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。汲取一定量桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用PBS稀釋成1、2、4、6、8、10g/mL系列質(zhì)量濃度，準(zhǔn)備制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。華而不實參考溶液為4g/mL的稀釋液。同時用各水產(chǎn)品空白組織提取液來稀釋桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)儲備液，得到1、2、4、6、8、10g/mL系列質(zhì)量濃度，制作桿菌肽在各基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，參考溶液為4g/mLPBS稀釋成的稀釋液。以上稀釋液均當(dāng)日配制。放置6個牛津杯于檢定平板上，間隔加滿參考溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液。4℃放置1h后于〔361〕℃培養(yǎng)10~12h,去掉牛津杯，精到準(zhǔn)確測量各藥物所產(chǎn)生的抑菌圈直徑〔精到準(zhǔn)確到0.02mm〕，最后用全部參考溶液抑菌圈直徑的平均值減去各平板參考溶液抑菌圈直徑平均值的差值，作為各自平板的校正值，校正其他標(biāo)準(zhǔn)溶液抑菌圈直徑的平均值。以上各組溶液質(zhì)量濃度的對數(shù)與該組被修正后的抑菌圈數(shù)值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。相關(guān)系數(shù)r應(yīng)不小于0.99.重復(fù)測定5次。6〕樣品前處理。準(zhǔn)確稱取勻漿好的肌肉試樣4g,參加提取液〔甲醇和0.1%甲酸水溶液體積比為3∶7〕10mL,渦旋30s,60℃加熱5min,超聲5min,8000r/min離心5min,取上清液于另一離心管。重復(fù)提取1次，合并上清液，參加15mL甲醇飽和正己烷，渦旋30s,6000r/min離心5min,棄去上層，重復(fù)1次。所得樣液于50℃旋蒸至干。參加1mLPBS復(fù)溶，過0.22m濾膜，供檢測。濃縮后樣液濃度為組織濃度的4倍。7〕藥物最低檢測限的測定。稱取4g空白勻漿好的肌肉組織〔草魚、鰻鱺、對蝦〕，每種肌肉各4份，分別參加桿菌肽0.5、1.0、1.5、2.0g,得到0.125、0.250、0.375、0.500g/g4個藥物添加量的試驗組，按樣品前處理方式方法進行樣品前處理，同時作空白對照，最后杯碟法測定。每個質(zhì)量濃度重復(fù)測定3次。結(jié)果以產(chǎn)生明顯抑菌圈〔一般抑菌圈直徑大于10mm,并且標(biāo)準(zhǔn)液參考質(zhì)量濃度抑菌圈清楚明晰可見〕的最低質(zhì)量濃度為藥物在組織內(nèi)的最低檢測限。8〕藥物回收率的測定。稱取3份4g空白勻漿好的肌肉組織，分別參加桿菌肽2、6、10g,使藥物在各組織樣品中的添加量分別為0.5、1.5、2.5g/g.經(jīng)樣品前處理方式方法處理后，樣液質(zhì)量濃度為2、6、10g/mL,同時杯碟法測定對應(yīng)質(zhì)量濃度的桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)液〔2、6、10g/mL〕。每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出各個樣品在處理后的質(zhì)量濃度和相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度，其比值為桿菌肽的絕對回收率。9〕桿菌肽的特異性測定。同時制備3種細菌藤黃微球菌、大腸桿菌和枯草芽胞桿菌的檢測平板，平板制作方式方法同藤黃微球菌。使用制作的3種細菌檢測平皿分別單一檢測多肽類藥物桿菌肽和其他類常用水產(chǎn)藥物的抑菌效果。重復(fù)3次。10〕杯碟法測定。定量檢測，置6個牛津杯于檢測平板內(nèi)，間隔參加樣液和4g/mL桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)液，〔361〕℃培養(yǎng)〔102〕h;定性檢測，置4個牛津杯于檢測平板內(nèi)，對角加樣液，余下2個牛津杯分別加2g/mL和4g/mL桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)液，同時參照桿菌肽的特異性測定結(jié)果。每個樣品3個平行。培養(yǎng)后測定抑菌圈大小，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算藥物質(zhì)量濃度。2結(jié)果與分析2.1桿菌肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線桿菌肽稀釋液質(zhì)量濃度的對數(shù)與抑菌圈直徑呈線性關(guān)系。以桿菌肽稀釋液質(zhì)量濃度的對數(shù)作為橫坐標(biāo)，以抑菌圈直徑作為縱坐標(biāo)，得到桿菌肽在各基質(zhì)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)。華而不實桿菌肽在1~10g/mL內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系