氨基酸類藥物

關于氨基酸類藥物第1頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四二、氨基酸類藥物的生產(chǎn)方法

1、目前全世界天然氨基酸的年總產(chǎn)量在百萬噸左右，其中產(chǎn)量較大者有谷氨酸、蛋氨酸及賴氨酸，其次為天門冬氨酸、苯丙氨酸及胱氨酸等。它們主要用于醫(yī)藥、食品、飼料及化工行業(yè)中。

2、氨基酸的生產(chǎn)方法有天然蛋白質(zhì)水解法、發(fā)酵法、酶轉化法及化學合成法等四種。

3、氨基酸及其衍生物類藥物已有百種之多，但主要是以20種氨基酸為原料經(jīng)酯化、?；⑷〈俺甥}等化學方法或酶轉化法生產(chǎn)。第2頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四（一）水解法1、基本原理與過程

以毛發(fā)、血粉及廢蠶絲等蛋白質(zhì)為原料，通過酸、堿或酶水解成多種氨基酸混合物，經(jīng)分離純化獲得各種藥用氨基酸的方法稱為水解法。目前用水解法生產(chǎn)的氨基酸有L-胱氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸及L-絲氨酸等。水解法生產(chǎn)氨基酸的主要過程為水解、分離和結晶精制三個步驟。

第3頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四（1）蛋白質(zhì)水解方法

目前蛋白質(zhì)水解分為酸水解法、堿水解法及酶水解法三種。①酸水解法：蛋白質(zhì)原料用6～10mol／L鹽酸或8mol／L硫酸于110～120℃（回流煮沸）水解12～24h，除酸后即得多種氨基酸混合物。此法優(yōu)點是水解迅速而徹底，產(chǎn)物全部為L-型氨基酸，無消旋作用。缺點是色氨酸全部被破壞，絲氨酸及酪氨酸部分被破壞，且產(chǎn)生大量廢酸污染環(huán)境。工業(yè)上較普遍采用。第4頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四②堿水解法：蛋白質(zhì)原料經(jīng)6mol／L氫氧化鈉或4mol／L氫氧化鋇于100℃水解6h即得多種氨基酸混合物。該法水解迅速而徹底，且色氨酸不被破壞，但含羥基或巰基的氨基酸全部被破壞，且產(chǎn)生消旋作用。工業(yè)上多不采用。③酶水解法：蛋白質(zhì)原料在一定pH和溫度條件下經(jīng)蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的過程稱為酶水解法。此法優(yōu)點為反應條件溫和，無需特殊設備，氨基酸不破壞，無消旋作用。缺點是水解不徹底，產(chǎn)物中除氨基酸外，尚含較多肽類。工業(yè)上很少用該法生產(chǎn)氨基酸而主要用于生產(chǎn)水解蛋白及蛋白胨。第5頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四（2）氨基酸分離方法

氨基酸分離方法較多，通常有溶解度法、等電點沉淀法、特殊試劑沉淀法、吸附法及離子交換法等。

①溶解度法：是依據(jù)不同氨基酸在水中或其它溶劑中的溶解度差異而進行分離的方法。

胱氨酸和酪氨酸均難溶于水，但在熱水中酪氨酸溶解度較大，而胱氨酸溶解度變化不大，故可將混合物中胱氨酸、酪氨酸及其它氨基酸彼此分開。

②特殊試劑沉淀法：系采用某些有機或無機試劑與相應氨基酸形成不溶性衍生物的分離方法。第6頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四③吸附法：是利用吸附劑對不同氨基酸吸附力的差異進行分離的方法。如顆?；钚蕴繉Ρ奖彼帷⒗野彼峒吧彼岬奈搅Υ笥趯ζ渌欠枷阕灏被岬奈搅?，故可從氨基酸混合液中將上述氨基酸分離出來。

④離子交換法：是利用離子交換劑對不同氨基酸吸附能力的差異進行分離的方法。氨基酸為兩性電解質(zhì)，在特定條件下，不同氨基酸的帶電性質(zhì)及解離狀態(tài)不同，故同一種離子交換劑對不同氨基酸的吸附力不同。第7頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四（3）氨基酸的精制方法

分離出的特定氨基酸中常含有少量其它雜質(zhì)，需進行精制，常用的有結晶和重結晶技術，也可采用溶解度法或結晶與溶解度法相結合的技術。丙氨酸在稀乙醇或甲醇中溶解度較小，且pI為6.0，故丙氨酸可在pH6.0時，用50％冷乙醇結晶或重結晶加以精制。

溶解度與結晶技術相結合的方法精制氨基酸。如在沸水中苯丙氨酸溶解度大于酪氨酸100倍，若將含少量酪氨酸的苯丙氨酸粗品溶于15倍體積（w／v）的熱水中，調(diào)pH4.0左右，經(jīng)脫色過濾可除去大部分酪氨酸；濾液濃縮至原體積的1／3，加2倍體積（v／v）的95％乙醇，4℃放置，濾取結晶，用95%乙醇洗滌，烘干即得苯丙氨酸精品。第8頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四2、用水解法生產(chǎn)氨基酸的品種及工藝

絕大多數(shù)氨基酸均可采用酸水解法生產(chǎn)，但目前由于發(fā)酵方法及酶工程技術的迅速發(fā)展，僅有幾種氨基酸仍采用酸水解法生產(chǎn)?，F(xiàn)胱氨酸與亮氨酸生產(chǎn)為例。L-胱氨酸（L-Cystine，L-Cys2）的制備：

（1）L-胱氨酸的結構與性質(zhì)：以毛、發(fā)及蹄甲等角蛋白中含量最多。其分子由兩分子半胱氨酸脫氫氧化而成，結構為：第9頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四L-胱氨酸自稀酸中形成六角形或六角柱形晶體，分解點258~261℃，pI為5.05，〔α〕25D為-232°。在25℃水中溶解度為0.011，在75℃水中為0.052。溶于無機酸及無機堿，在熱堿液中可被分解。不溶于乙醇、乙醚及丙酮。可被還原為L-半胱氨酸。（2）工藝路線第10頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四

（3）工藝過程①水解：在1-1.5h內(nèi)升溫至110～117℃水解7h（自100℃時計）后出料,玻璃布過濾,收集濾液。②中和：用30%工業(yè)堿調(diào)至pH4.8，靜置36h，滌綸布濾取沉淀，離心甩干得L-胱氨酸粗品Ⅰ。③粗制：加入10mol/L鹽酸、水，升溫至65～70℃，攪拌0.5小時，加活性炭16kg/0.2t粗品Ⅰ

，于80～90℃保溫0.5h，濾除活性炭。用30%工業(yè)堿調(diào)濾液至pH4.8，靜置結晶，吸出上清液后，底部沉淀經(jīng)離心甩干得胱氨酸粗品（Ⅱ）。第11頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四④精制、中和：粗品Ⅱ加入1mol/LHCl，升溫至70℃，加活性炭1.5～2.5kg/50kg粗品Ⅱ

，85℃攪拌0.5h，過濾，加1.5倍體積蒸餾水，升溫至75～80℃，攪拌下用12％氨水（化學純）中和至pH3.5～4.0，析出結晶，濾取胱氨酸結晶，蒸餾水洗至無氯離子，真空干燥得L-胱氨酸成品。⑤檢驗與含量測定：應為六角形或六角柱形白色結晶，含量在98.5％以上，干燥失重小于0.5％，熾灼殘渣小于0.2％，氯化物小于0.15％，鐵鹽小于0.001％，重金屬小于20ppm。⑥作用與用途：L-胱氨酸具有增強造血機能、升高白細胞、促進皮膚損傷的修復及抗輻射作用。臨床上用于治療輻射損傷、重金屬中毒、慢性肝炎、牛皮癬及病后或產(chǎn)后繼發(fā)性脫發(fā)。第12頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四(二)發(fā)酵法

1、基本原理與過程工業(yè)上，發(fā)酵實質(zhì)上是利用微生物細胞中酶的作用，將培養(yǎng)基中有機物轉化為細胞或其它有機物的過程。利用微生物代謝中間產(chǎn)物加入NH3或HNO3，合成氨基酸。第13頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第14頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四★初生氨基酸：微生物通過固氮作用、硝酸還原及自外界吸收氨使酮酸氨基化成相應的氨基酸，或微生物通過轉氨酶作用，將一種氨基酸的氨基轉移到另一種酮酸上，生成的新氨基酸也稱為初生氨基酸?！锎紊被幔涸谖⑸镒饔孟拢猿跎被釣榍绑w轉化成的其它氨基酸。大多數(shù)氨基酸均可通過以初生氨基酸為原料的微生物轉化作用而產(chǎn)生。第15頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四第16頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四

2、發(fā)酵法生產(chǎn)的氨基酸品種及工藝

微生物利用碳源、氮源及鹽類幾乎可合成所有氨基酸。目前絕大部分氨基酸皆可通過發(fā)酵法生產(chǎn)，其缺點是產(chǎn)物濃度低，設備投資大，工藝管理要求嚴格，生產(chǎn)周期長，成本高。本文僅以L-異亮氨酸直接發(fā)酵法為例，說明發(fā)酵法的基本過程。第17頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四

L-異亮氨酸（L-Isoleucine，L-Ile）的制備

（1）L-異亮氨酸的結構與性質(zhì)：L-Ile存在子所有蛋白質(zhì)中，為人體必需氨基酸之一，分子式為C6H13NO2，分子量為131.17，結構式為：第18頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四L-Ile在乙醇中形成菱形葉片狀或片狀晶體，分解點為285～286℃，L-Ile溶于熱醋酸，在20℃乙醇中溶解度為0.072，在25℃水中為4.12，在75℃水中為6.08，不溶于乙醚。

（2）工藝路線第19頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四

（3）工藝過程①

菌種培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基組成（%）為：葡萄糖2尿素0.3玉米漿2.5豆餅水解液0.1（以干豆餅計）pH6.5。二級種子培養(yǎng)基另加菜籽油0.4，其余同一級種子培養(yǎng)基。一級種子培養(yǎng)：1000ml三解瓶中培養(yǎng)基裝量為200ml，接種一環(huán)牛肉膏斜面AS1.998菌種，搖床30℃培養(yǎng)（沖程7cm，頻率105次／min）16h。二級種子培養(yǎng)：接種量3.5％，培養(yǎng)8h，如此逐級第20頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四放大培養(yǎng)得足夠量菌種。

②滅菌、發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)液組成（%）為:

硫酸銨4.5豆餅水解液0.4，玉米漿2.0

碳酸鈣4.5pH7.2，淀粉水解還原糖初糖濃度11.5。在5m3發(fā)酵罐中添加3噸發(fā)酵培養(yǎng)液，加熱至118～120℃，維持在1.1×105Pa壓力，滅菌30min，立即通冰鹽水冷卻至25℃。接入1％菌種（v／v），維持180轉／min的攪拌速度，升溫至30～31℃，以0.2L／（min·L）通氣量發(fā)酵60h，在24～50h之間不斷補加尿素至0.6，氨水至0.27。

第21頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四③除菌體、酸化發(fā)酵結束后，發(fā)酵液加熱至100℃并維持10min，冷卻過濾，濾液加工業(yè)硫酸和草酸至pH3.5，過濾除沉淀。④離子交換、吸附分離上述濾液每分鐘以樹脂量1.5％的流速進H十-型732離子交換柱（Φ40×100cm），以100L去離子水洗柱，再以60℃、0.5mol／L氨水按3L/min的流速進行洗脫，分部收集洗脫液。第22頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四⑤濃縮趕氨

合并pH3～12的洗脫液，70～80℃減壓蒸餾、濃縮至粘稠狀，加去離子水至原體積的1／4，再濃縮至粘稠狀。如此重復三次。⑥脫色、濃縮、中和上述濃縮物加去離子水至原體積的1／4，攪拌均勻，加2mol／L鹽酸調(diào)pH3.5，加上1％（w／v）活性炭，70℃攪拌脫色1h。濾除活性炭，濾液減壓濃縮至適當體積，用2mol／L氨水調(diào)pH6.0，5℃沉淀過夜,過濾抽干，105℃烘干得：L-異亮氨酸半成品。第23頁，共26頁，2023年，2月20日，星期四⑦精制、烘干

每10kgL-異亮氨酸半成品加8L濃鹽酸和20L去離子水，加熱至80℃，攪拌溶解，加10kg氯化鈉至飽和，加工業(yè)堿液調(diào)pH10.5，過濾，濾液用堿調(diào)pH1.5，5℃放置過夜。濾取沉淀，用80L，去離子水加熱至80℃攪拌溶解，加適量氯化鈉和1%（w／v）活性炭，70℃攪拌脫色lh過濾，濾液減壓濃縮至適當濃度，用氨水調(diào)pH6.0，5℃放置結晶過夜。次日過濾收集結晶，抽干，于105℃烘房中烘干得L-異亮氨酸成品。