臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)-第三章臨床細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

第一篇臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)

第三章臨床細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

病原生物學(xué)與檢驗(yàn)教研室1正確的采集和處理標(biāo)本正確的選擇檢驗(yàn)程序和檢驗(yàn)方法正確的發(fā)出檢驗(yàn)報(bào)告

臨床微生物檢驗(yàn)工作的重要組成細(xì)菌學(xué)診斷的依據(jù)：形態(tài)結(jié)構(gòu)特征；菌落特征；生化反應(yīng)；血清學(xué)實(shí)驗(yàn)2本章學(xué)習(xí)目標(biāo)1.細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查方法及細(xì)菌觀察辨認(rèn)指標(biāo)；2.染色標(biāo)本檢查的基本程序及革蘭氏染色法；3.培養(yǎng)基概念、種類及其制備；4.細(xì)菌接種與分離技術(shù)；5.細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)現(xiàn)象及其觀察指標(biāo)6.常用生化反應(yīng)原理、培養(yǎng)基、結(jié)果判定和應(yīng)用7.細(xì)菌的非培養(yǎng)檢測(cè)方法及其意義。3第一節(jié)細(xì)菌形態(tài)學(xué)檢查4

細(xì)菌的形態(tài)檢驗(yàn)是利用顯微鏡，通過(guò)染色或不染色標(biāo)本,對(duì)細(xì)菌的大小、形態(tài)、排列、特殊結(jié)構(gòu)、動(dòng)力及染色性等特點(diǎn)進(jìn)行觀察分析的方法。

意義？可以迅速了解標(biāo)本中有無(wú)細(xì)菌及大致的菌量

；根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和染色等初步判斷

；對(duì)進(jìn)一步的細(xì)菌生化和血清學(xué)鑒定、臨床初步診斷、選擇抗生素等提供依據(jù)

。5

種類特點(diǎn)用途普通光學(xué)顯微鏡

可見(jiàn)光直射,千倍染色細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)暗視野顯微鏡

散射光,暗視野聚光器活菌/螺旋體的動(dòng)力

相差顯微鏡

相差板變光相與振幅活菌形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)熒光顯微鏡

高壓汞燈紫外光紫藍(lán)光抗原抗體輔助診斷熒光素標(biāo)記細(xì)菌病毒電子顯微鏡

電子流，強(qiáng)磁透鏡透射表面與超微結(jié)構(gòu)

掃描，數(shù)十萬(wàn)~一百萬(wàn)

實(shí)驗(yàn)室常用顯微鏡【補(bǔ)充內(nèi)容】6

普通光學(xué)顯微鏡的分辨率為0.25um。一般細(xì)菌都大于0.25um，故可用普通光學(xué)顯微鏡觀察。普通光學(xué)顯微鏡7目的：主要觀察活菌的動(dòng)力及運(yùn)動(dòng)狀況常用方法：壓滴法、懸滴法和毛細(xì)管法常用顯微鏡：暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、

普通光學(xué)顯微鏡觀察：有鞭毛細(xì)菌——方向性位移無(wú)鞭毛細(xì)菌——布朗運(yùn)動(dòng)（原地顫動(dòng)）常見(jiàn)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)流星樣/穿梭樣運(yùn)動(dòng)(霍亂弧菌)；投鏢樣/螺旋樣運(yùn)動(dòng)(空腸彎曲菌)；翻滾螺旋運(yùn)動(dòng)(小腸耶爾森菌)；旋轉(zhuǎn)/伸屈/滾動(dòng)/蛇行運(yùn)動(dòng)（梅毒螺旋體）一、不染色標(biāo)本8壓滴法懸滴法

影響因素1.避免菌液外溢和產(chǎn)生氣泡，并造成生物污染。2.盡快觀察，注意保溫3.玻片厚度1.0-1.1mm，清潔無(wú)油漬4.光線不宜過(guò)亮。9目的：清楚觀察細(xì)菌(死菌)的形態(tài)、大小、排列方式和染色性。（一）常用染料堿性染料：帶正電荷；常用結(jié)晶紫、美蘭、孔雀綠、堿性復(fù)紅等；細(xì)菌帶負(fù)電荷，易被堿性染料染色。酸性染料：帶負(fù)電荷；常用伊紅、酸性復(fù)紅等

中性染料：堿性染料+酸性染料，也稱復(fù)合染料二、染色標(biāo)本10（二）常用的染色方法細(xì)菌學(xué)中最經(jīng)典、最常用的染色法根據(jù)染色結(jié)果，把細(xì)菌分為G+菌和G-菌染色結(jié)果為紫色——G+菌染色結(jié)果為紅色——G-菌目的對(duì)病原菌的初步鑒定為臨床選擇用藥提供參考致病性不一樣,指導(dǎo)臨床制定治療方案1.

革蘭染色法（Gramstaining）111.涂片：液體標(biāo)本直接涂片；固體培養(yǎng)物+生理鹽水→涂布2.干燥：切勿高溫，以防高溫使細(xì)菌變形3.固定：目的？殺死細(xì)菌；改變細(xì)胞壁通透性；菌體與玻片牢固黏附4.染色：?jiǎn)稳痉ā?fù)染法復(fù)染色法一般步驟：初染→媒染→脫色→復(fù)染5.鏡檢：干燥后；油鏡觀察制片染色標(biāo)本檢查的基本程序★【補(bǔ)充內(nèi)容】12

涂片干燥固定結(jié)晶紫

碘液

95%乙醇復(fù)紅1min1min

脫色染色革蘭染色法結(jié)晶紫盧戈碘液無(wú)水乙醇酸性復(fù)紅G+菌紫色紅色G-菌染色結(jié)果

[原理]

⑴滲透學(xué)說(shuō)（細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)）⑵化學(xué)學(xué)說(shuō)

⑶等電點(diǎn)學(xué)說(shuō)

13

革蘭陽(yáng)性

革蘭陰性14[注意事項(xiàng)]1.涂片取菌（標(biāo)本）過(guò)程嚴(yán)格無(wú)菌操作；涂片厚薄均勻，一般涂呈云霧狀薄片，拇指大小；2.自然干燥為好，若烘干要緩慢，玻片不燙手為度；玻片標(biāo)本必須經(jīng)固定，一般火焰快速往返3次；3.玻片稍放涼方能加染料染色；

染料加量適宜，要覆蓋整個(gè)涂片區(qū)域并不外流；4.染色步驟的順序不能調(diào)亂，時(shí)間嚴(yán)格把握，但脫色時(shí)間可依涂片厚薄適當(dāng)調(diào)整；5.沖水時(shí)連同染料隨流水沖去，不宜先將染料倒去再?zèng)_6.染色完畢要待玻片完全干燥才能滴油鏡檢?！?52.萋-尼抗酸染色法常用于結(jié)核分枝桿菌等抗酸菌的檢查抗酸菌染成紅色，其他背景染成藍(lán)色

3.熒光染色法敏感性強(qiáng)，容易觀察結(jié)果用熒光顯微鏡觀察大腸桿菌（熒光染色）結(jié)核桿菌（抗酸染色）164.特殊染色法

鞭毛染色法

莢膜染色法

芽胞染色法沙門菌周鞭毛5.負(fù)染法

墨汁染色法產(chǎn)氣莢膜梭菌莢膜新生隱球菌莢膜產(chǎn)氣莢膜梭菌芽胞17

第二節(jié)

細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定18儀器設(shè)備接種環(huán)/針紅外接種滅菌器/酒精燈培養(yǎng)皿（平皿）培養(yǎng)箱高壓蒸汽滅菌器干烤箱超凈臺(tái)/生物安全柜培養(yǎng)基……基本實(shí)驗(yàn)條件平皿19一、培養(yǎng)基的種類和選擇培養(yǎng)基：是指用人工方法配制而成，專供微生物生長(zhǎng)繁殖使用的混合營(yíng)養(yǎng)物制品。(一)常用培養(yǎng)基的分類1.按培養(yǎng)基的成分分2.按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分

合成培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基

(斜面、平板)20液體培養(yǎng)基+2-3%瓊脂固體培養(yǎng)基+0.2-0.5%瓊脂半固體培養(yǎng)基用于大量繁殖細(xì)菌（增菌）動(dòng)力檢查保存菌種平板細(xì)菌分離培養(yǎng)斜面增菌純培養(yǎng)保存菌種213.按培養(yǎng)基的用途分⑴基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)成分，是配制其他培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。普通營(yíng)養(yǎng)肉湯普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面22⑵營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入血液、血清、雞蛋、葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，供營(yíng)養(yǎng)要求較高和需要特殊生長(zhǎng)因子的細(xì)菌生長(zhǎng)。

血瓊脂平板（除了提供營(yíng)養(yǎng)外，還能觀察細(xì)菌的溶血現(xiàn)象，用于鑒定）巧克力色血平板23⑶選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入抑制劑，目的是抑制雜菌的生長(zhǎng)，有利于目標(biāo)菌的生長(zhǎng)。SS平板膽鹽抑制G+菌生長(zhǎng)；煌綠和枸椽酸鈉抑制非致病性腸道桿菌生長(zhǎng)，利于沙門菌和志賀菌的生長(zhǎng)。24⑷鑒別培養(yǎng)基：利用細(xì)菌的分解代謝能力和產(chǎn)物的不同，在培養(yǎng)基中加入了一些特定的作用底物和指示劑，通過(guò)指示不同的生化反應(yīng)來(lái)鑒別細(xì)菌。伊紅美蘭(EMB)平板（選擇+鑒定）各種生化反應(yīng)試劑25⑸特殊培養(yǎng)基：①厭氧培養(yǎng)基：專供厭氧菌的分離、培養(yǎng)和鑒別。（如皰肉培養(yǎng)基、巰基乙醇酸鈉培養(yǎng)基等）②細(xì)菌L型培養(yǎng)基：加入3～5%NaCl、10～20%蔗糖或7%聚乙烯吡咯烷酮等低營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。營(yíng)養(yǎng)肉湯普通肉渣石蠟皰肉培養(yǎng)基261.按物理狀態(tài)分，培養(yǎng)基有哪幾種？其用途分別為？

液體培養(yǎng)基——增菌

半固體培養(yǎng)基——觀察動(dòng)力、保存菌種

固體培養(yǎng)基：平板——分離細(xì)菌斜面——分純、增菌

復(fù)習(xí)2.按用途分，培養(yǎng)基分為哪幾種？各舉1例。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：普通肉湯、普通瓊脂平板/斜面

營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：血平板、巧克力平板

選擇培養(yǎng)基：SS瓊脂平板、慶大霉素平板

鑒別培養(yǎng)基：糖發(fā)酵管、生化鑒定管

特殊培養(yǎng)基：庖肉培養(yǎng)基27(二)培養(yǎng)基的選擇臨床標(biāo)本兼性厭氧菌培養(yǎng)基備注血、骨髓血培養(yǎng)液,BA,CA必要時(shí)做厭氧培養(yǎng)LKV或CAN穿刺液、膿汁BA,CA,MAC腦脊液BA,CA尿液BA,MAC同時(shí)做尿液計(jì)數(shù)糞、肛拭SS,MAC,EB弧菌科感染加TCBS痰液BA,MAC結(jié)核患者用L-J培養(yǎng)基生殖道分泌液BA,CA,TM或MTM真菌感染用沙氏培養(yǎng)基臨床常見(jiàn)標(biāo)本培養(yǎng)基的首選原則注：BA:血平板；CA:巧克力平板；MAC:麥康凱平板；SS:沙門菌志賀菌選擇平板；TCBS:硫代硫酸鹽-枸櫞酸鹽-膽鹽-蔗糖平板；EB:腸道增菌肉湯；TM或MTM:用于淋球菌培養(yǎng)；LKV:萬(wàn)古/卡那霉素溶血培養(yǎng)基；CAN:黏菌素-萘啶酸厭氧培養(yǎng)基；L-J：改良羅氏培養(yǎng)基；28(一)

細(xì)菌的分離（接種技術(shù)）根據(jù)標(biāo)本類型、檢驗(yàn)?zāi)康募芭囵B(yǎng)基的性狀，采用不同的分離和培養(yǎng)方法二、細(xì)菌的分離培養(yǎng)1.平板劃線法：分離出單個(gè)菌落

分區(qū)劃線法——含菌量多的標(biāo)本

連續(xù)劃線法——含菌量少的標(biāo)本2.斜面接種法：純培養(yǎng)、增菌、保存菌種、生化試驗(yàn)3.液體接種法：增菌、生化試驗(yàn)管的接種4.穿刺接種法：動(dòng)力試驗(yàn)(半固體)、高層瓊脂5.傾注平板法：定量培養(yǎng)、細(xì)菌計(jì)數(shù)6.涂布接種法：藥敏試驗(yàn)K-B法、細(xì)菌計(jì)數(shù)29目的：把含菌量多的臨床標(biāo)本接種到固體培養(yǎng)基表面，并將其分散，從而獲得單個(gè)菌落,獲得純種細(xì)菌。方法：分區(qū)劃線，逐步稀釋；每區(qū)從“點(diǎn)”→“線”，使標(biāo)本分散、稀釋。平板分區(qū)劃線法30菌落純培養(yǎng)(pureculture)液體培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基3132先加1ml樣品傾注培養(yǎng)基33(二)

細(xì)菌的培養(yǎng)方法

1.需氧培養(yǎng)

臨床細(xì)菌室最常用的方法

適用于需氧或兼性厭氧菌的培養(yǎng)；

常于37℃(因菌種而異)

，培養(yǎng)18~24h

；

2.二氧化碳培養(yǎng)法

CO2培養(yǎng)箱；燭缸法微需氧(5%~6%O2+5%~10%CO2+85%N2)

3.厭氧培養(yǎng)：化學(xué)產(chǎn)氣法；專用厭氧培養(yǎng)箱

同一份標(biāo)本常同時(shí)采用2～3種不同的培養(yǎng)法34CO2培養(yǎng)箱35細(xì)菌在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況1.在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況菌膜菌沉淀均勻渾濁對(duì)照【補(bǔ)充內(nèi)容】36

2.在半固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況：有鞭毛的細(xì)菌(動(dòng)力+)可沿穿刺線擴(kuò)散生長(zhǎng)，呈羽毛狀或云霧狀無(wú)鞭毛細(xì)菌(動(dòng)力-)只能沿穿刺線生長(zhǎng)，呈線狀,

線兩旁培養(yǎng)基澄清37劃線接種18-24小時(shí)培養(yǎng)后,可見(jiàn)菌落和菌苔3.在固體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況：

38菌落：由單個(gè)細(xì)菌分裂繁殖后形成的肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌集團(tuán)。菌落特征的描述（大小、形態(tài)、顏色、氣味、透明度、表面突起或扁平、光滑或粗糙、濕潤(rùn)或干燥、邊緣整齊與否、溶血等其他特征等）

菌苔細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上繁殖成的一片密集的的細(xì)菌群落。3940菌落的類型：

光滑型（S型）菌落粗糙型

(R型)菌落黏液型（M

型）菌落41大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(糖、蛋白質(zhì)等)胞外酶單糖、短肽、脂肪酸細(xì)菌的分解代謝：丙酮酸三、生化反應(yīng)細(xì)菌的生化鑒定技術(shù)：利用生化試驗(yàn)的方法來(lái)檢測(cè)細(xì)菌對(duì)各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒別細(xì)菌的方法。42(一)碳水化合物的代謝試驗(yàn)

1.糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗(yàn)2.氧化-發(fā)酵(O/F)試驗(yàn)

3.β-半乳糖苷酶(ONPG)試驗(yàn)4.七葉苷水解試驗(yàn)

5.甲基紅試驗(yàn)(M)6.V-P(伏-普)試驗(yàn)(V)(二)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)

1.明膠液化試驗(yàn)2.吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)(I)3.硫化氫試驗(yàn)(S)4.尿素分解試驗(yàn)(U)

5.苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)6.氨基酸脫羧酶試驗(yàn)√√√√43試驗(yàn)原理培養(yǎng)基原色結(jié)果觀察陽(yáng)性結(jié)果

應(yīng)用糖醇苷類發(fā)酵各種糖發(fā)酵管紅/紫直接觀察

黃色O/FH-L液

紫直接觀察

黃色ONPGONPG液

無(wú)色直接觀察

黃色七葉苷七葉苷

黃色直接觀察

黑色甲基紅葡萄糖蛋白胨水淡黃滴加甲基紅

紅色V-P滴加甲液(α-奈酚酒精)

和乙液(KOH)

碳水化合物的代謝試驗(yàn)列表歸納44++--對(duì)照糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗(yàn)最主要和最基本的生化試驗(yàn)45氧化/發(fā)酵（O/F）試驗(yàn)石蠟發(fā)酵型(F)氧化型(O)產(chǎn)堿型(-/-)石蠟石蠟?zāi)c桿菌科(F)與非發(fā)酵菌(O/-)的鑒別46+-遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌的快速鑒定ONPG試驗(yàn)七葉苷水解試驗(yàn)D群鏈球菌(+)與其他鏈球菌(-)的鑒別47甲基紅(M)試驗(yàn)?zāi)c桿菌科的鑒別；一般M+，V-V-P試驗(yàn)接種培養(yǎng)后，先滴加甲基紅試劑再觀察結(jié)果接種培養(yǎng)后先滴加VP甲液、乙液各1滴，再觀察結(jié)果48試驗(yàn)原理培養(yǎng)基原色結(jié)果觀察陽(yáng)性結(jié)果

應(yīng)用

明膠明膠

無(wú)直接觀察

液化

吲哚

蛋白胨水淡黃滴加靛基質(zhì)試劑兩液交界面玫瑰紅色硫化氫醋酸鉛

無(wú)色直接觀察

黑色尿素酶尿素

淡橙直接觀察

玫紅色苯丙氨酸脫氨苯丙氨酸瓊脂

無(wú)色滴FeCl34-5滴

綠色氨基酸脫羧酶賴/鳥(niǎo)/精氨酸

棕色直接觀察

紫色蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn)列表歸納49明膠液化試驗(yàn)半固體液化-+50吲哚試驗(yàn)(I)

腸桿菌科細(xì)菌的鑒定_+大腸埃希菌-沙門菌+大腸埃希菌+沙門菌-硫化氫試驗(yàn)(S)51尿素(U)分解試驗(yàn)對(duì)照陽(yáng)性陰性腸桿菌科中變形桿菌屬(+)的鑒定苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)52氨基酸脫羧酶試驗(yàn)

對(duì)照管賴氨酸鳥(niǎo)氨酸精氨酸石蠟

腸桿菌科細(xì)菌的鑒定53

應(yīng)用于腸桿菌科細(xì)菌的鑒定

枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)(C)丙二酸鹽利用試驗(yàn)原色為綠色深藍(lán)色為陽(yáng)性陽(yáng)性陰性直接觀察結(jié)果(三)碳源和氮源利用試驗(yàn)54

1.氧化酶試驗(yàn)?zāi)c桿菌科細(xì)菌(-)與假單胞菌(+)的鑒別（－）（+）(四)各種酶類試驗(yàn)挑取菌落于濾紙上滴加氧化酶試劑，菌落變紫

2.觸酶(過(guò)氧化氫酶)試驗(yàn)產(chǎn)生氣泡（+）無(wú)氣泡（-）

G+球菌的初步分類(葡萄球菌+、鏈球菌-)553.硝酸鹽還原試驗(yàn)+原理：P40培養(yǎng)基：硝酸鹽試劑原色：無(wú)或淡黃色結(jié)果觀察：培養(yǎng)后滴加甲液(對(duì)氨基苯磺酸)、乙液(α萘胺)各1滴陽(yáng)性顏色：紅色應(yīng)用：腸桿菌科+、假單胞菌74%+及不動(dòng)桿菌-的鑒定-√56

4.脂酶試驗(yàn)操作同氧化酶試驗(yàn)，深藍(lán)色為+用于厭氧菌的鑒別

5.卵磷脂酶試驗(yàn)菌落周圍有混濁沉淀圈為+57

6.DNA酶試驗(yàn)金黃色葡萄球菌、沙雷菌及變形桿菌(+)菌落周圍有透明圈為+

9.膽汁溶菌試驗(yàn)對(duì)照管有菌生長(zhǎng)

加膽汁溶菌澄清

肺炎鏈球菌(+)甲型鏈球菌(-)58

7.凝固酶試驗(yàn)

應(yīng)用于致病性與非致病性葡萄球菌的鑒定598.CAMP試驗(yàn)B群鏈球菌CAMP因子產(chǎn)生促進(jìn)金黃色葡萄球菌的β溶血

應(yīng)用于鏈球菌屬間的鑒定B群鏈球菌金黃色葡萄球菌箭頭溶血60(五)抑菌試驗(yàn)

2.桿菌肽試驗(yàn)3.奧普托欣(Optochin)試驗(yàn)1.O/129抑菌試驗(yàn)61【實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)P31】

復(fù)合生化實(shí)驗(yàn)1.克氏雙糖鐵試驗(yàn)

應(yīng)用：腸桿菌科的鑒定用途：⑴增菌(斜面)⑵動(dòng)力(底層)：穿刺線模糊/清晰；⑶生化反應(yīng)：底層：葡萄糖（+黃有氣裂、+黃、-紅）斜面：乳糖（+黃、-紅）

H2S(底層)：+黑柱或瓊脂全黑色、-無(wú)黑色KIA斜面培養(yǎng)基（中性紅指示劑，原色為紅色）62

常見(jiàn)KIA