細菌的培養(yǎng)及鑒定思路

關(guān)于細菌的培養(yǎng)及鑒定思路第1頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五標本采集原則1.及時采集微生物標本作病原學(xué)檢查2.在抗菌藥物使用前采集標本3.采樣時嚴格執(zhí)行無菌操作4.標本容器須無菌，但不得有消毒劑5.采樣后立即送檢6.送檢標本應(yīng)注明來源和檢驗?zāi)康牡?頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五咳痰方法病人先漱口，清潔口腔，去除表面的菌群病人深咳，收集從下呼吸道咳出的痰液無痰可用3％～5％NaCl5ml霧吸約5min導(dǎo)痰以清晨第二口痰為佳標本采集后放置時間不超過2小時

第3頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五清潔中段尿液盡量取早晨第一次尿液囑患者留取標本的前一天晚上少飲水女性病人收集標本前用肥皂水沖洗外陰，再以滅菌清水沖洗尿道口排出幾毫升后，不停止尿流，采集中段尿男性病人翻轉(zhuǎn)包皮，清洗尿道口排出幾毫升后，不停止尿流,采集中段尿

采集標本后立即送檢！第4頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五標本接收原則嚴格實行核對制度：包括姓名、性別、年齡、門診號/住院號、病床號、標本類型、容器、標識、檢驗?zāi)康牡?。所有拒收或退回標本均?yīng)在登記本上登

記，登記內(nèi)容包括：病人姓名、病區(qū)、床號

送檢醫(yī)師、送檢項目、拒收(退回)原因、拒收時間、經(jīng)手人等第5頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五痰標本涂片染色低倍鏡下分類分級白細胞（個）上皮細胞（個）A>25<10B>25<25C<10>25A、B兩種情況的痰適合做培養(yǎng)，C不合格，應(yīng)重新留標本第6頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五哥倫比亞血平板—營養(yǎng)要求高的細菌巧克力平板—含V、X因子，主要培養(yǎng)嗜血桿菌、腦膜炎球菌和淋球菌用中國藍/麥康凱平板—G-桿菌用SS平板—沙門氏菌和志賀氏菌用M-H平板—細菌藥敏用TCBS平板—弧菌科細菌用沙包氏平板—真菌培養(yǎng)用真菌顯色平板—真菌培養(yǎng)用羅氏培養(yǎng)基—分枝桿菌用常用的培養(yǎng)基種類和用途第7頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五接種工具接種針和接種環(huán)：由三部分組成，即環(huán)（針）、金屬柄和絕緣柄接種針：用于穿刺接種細菌接種環(huán)：用于固體、液體培養(yǎng)基的細菌接種第8頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五器具：接種環(huán)（上）和接種針（下）

柄約22cm2—5cm絕緣柄約7.5cm金屬柄約14.5cm5—8cm安裝環(huán)(針)的螺口(約8mm)第9頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五操作原則：無菌操作（燒灼滅菌）Asepticarea10-20cm外焰焰芯內(nèi)焰第10頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細菌接種的基本程序滅菌接種環(huán)沾取標本接種滅菌接種環(huán)殺滅接種環(huán)沾染的細菌，以免污染標本殺滅接種環(huán)沾染的細菌，以免污染環(huán)境第11頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細菌接種法平板劃線接種法：

★目的：使混合的細菌呈單個分散生長，形成單個菌落，以便獲得純菌。

★方法：★分區(qū)劃線法：適用于含菌量較多的標本★連續(xù)劃線法：適用于含菌量較少的標本液體培養(yǎng)基接種法穿刺接種法:用于觀察細菌動力斜面接種法傾注培養(yǎng)法:用于細菌計數(shù)第12頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五分區(qū)劃線法(3區(qū))第一區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第二區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第三區(qū)劃線滅菌接種環(huán)第13頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五連續(xù)劃線法第14頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第15頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細菌培養(yǎng)法一般培養(yǎng)（需氧培養(yǎng)）：★培養(yǎng)溫度：35℃（采用恒溫培養(yǎng)箱）★培養(yǎng)時間：18～24h二氧化碳培養(yǎng)法：燭缸法、二氧化碳培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)法：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧袋、厭氧罐、皰肉培養(yǎng)法、硫乙醇酸鹽法等第16頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細菌在固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象菌落★定義：指單個細菌在平板培養(yǎng)基上生長繁殖，形成單一肉眼可見的細菌集團?！锞涮卣鳎捍笮?、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性★菌落類型：光滑型（S）、粗糙型（R）、黏液型（M）菌苔：指多個菌落融合在一起形成的細菌堆積物。第17頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五菌落第18頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五菌落與菌苔第19頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五菌落的三個類型：

1.光滑型菌落（SmoothtypeColony）：又稱S型2.粗糙型菌落（RoughtypeColony）：又稱R型3.粘液型菌落（MucoidtypeColony）又稱M型第20頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五2023/3/621S型菌落第21頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五R型菌落第22頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五M型菌落第23頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象混濁沉淀：多見于鏈狀排列的細菌菌膜：多見于厭氧菌第24頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細菌在液體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象：第25頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有鞭毛細菌：在培養(yǎng)基中沿穿刺線并向外擴散生長，穿刺線邊緣模糊。無鞭毛細菌：只沿穿刺線生長，穿刺線邊緣清晰。第26頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細菌在半固體培養(yǎng)基中的生長現(xiàn)象有動力現(xiàn)象無動力現(xiàn)象第27頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五斜面接種法第28頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五接種斜面后菌落生長示意圖（菌苔）第29頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五革蘭染色原理：通過結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，故遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網(wǎng)孔縮小，再加上它不含類脂，故乙醇處理不會出現(xiàn)縫隙，，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過乙醇脫色后仍呈無色，再經(jīng)復(fù)紅等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。第30頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五

革蘭染色步驟

涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定第31頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五固定的目的：使細菌的細胞凝固，使菌體與玻片粘得更牢固；可改變菌體對染料的通透性；加熱固定可殺死細菌，比較安全。第32頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五

結(jié)晶紫1’碘液1’

95%乙醇

30”復(fù)紅1’

沖洗濾紙干燥

油鏡觀察沖洗沖洗沖洗革蘭染色程序初染媒染脫色復(fù)染第33頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五紫色（G＋）革蘭氏染色步驟示意圖革蘭染色甲菌乙菌初染結(jié)晶紫媒染碘液脫色乙醇復(fù)染稀釋復(fù)紅紫色（G＋）紅色（G-）革蘭染色步驟示意圖第34頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五【結(jié)果】細菌被染成紫色者，稱為革蘭陽性菌；而細菌染成紅色者，稱為革蘭陰性菌；陽性菌——紫色（G+b)

陰性菌——紅色（G-b)第35頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五G+

球菌第36頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五顯微鏡下的桿菌G-桿菌Figure2-GramstainofGram-E.colicells第37頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五革蘭染色注意事項標本涂片不宜太厚固定不宜過熱脫色不宜過度選用培養(yǎng)18--24小時菌齡的細菌為宜第38頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五抗酸染色原理：分枝桿菌細胞壁含脂質(zhì)較多,其中主要成分為分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色時與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固,能抵抗酸性乙醇的脫色作用,因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色,達到染色目的。第39頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五

抗酸染色步驟

1、涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定第40頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五抗酸染色步驟2、染色包括初染、脫色、復(fù)染三步。

石炭酸復(fù)紅維持3-5’3%鹽酸酒精30’’

~1’美藍復(fù)染1’

沖洗干燥

油鏡觀察沖洗沖洗初染脫色復(fù)染第41頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五抗酸染色結(jié)果抗酸菌呈紅色，常堆積成團，排列無序，偶呈分枝狀生長。背景及非抗酸性細菌呈蘭色。第42頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五抗酸染色注意事項為防止交叉感染，標本先高壓滅菌后再涂片染色染色充分脫色時間寧長勿短在涂抹痰標本時嚴禁對載玻片進行加熱第43頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五臨床標本培養(yǎng)基選擇血：血培養(yǎng)瓶中斷尿：血平板、mac平板腦脊液：血培養(yǎng)瓶、血平板、巧克力平板穿刺液：血培養(yǎng)瓶、血平板、巧克力平板、mac平板膽汁：血平板、巧克力平板、mac平板大便:.麥康凱、SS、血平板第44頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五臨床標本培養(yǎng)基選擇生殖道標本根據(jù)臨床醫(yī)生所寫的檢驗項目接種相應(yīng)的平板及操作：

淋球菌培養(yǎng)接種淋球菌平板;念珠菌培養(yǎng)接種沙保羅培養(yǎng)基；支原體培養(yǎng)則按《支原體培養(yǎng)的操作規(guī)程》操作；作普通培養(yǎng)則接種血平板和巧克力平板

第45頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五觀察細菌在平板上的生長現(xiàn)象血平板：大小、形狀、邊緣、顏色、表面、透明度、濕潤度、黏度、溶血性mac平板：大小、形狀、顏色、透明度、濕潤度、黏度巧克力平板：大小、形狀、顏色、透明度、濕潤度、黏度第46頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五無菌部位標本第47頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五2023/3/648

革蘭陰性菌葡萄球菌第48頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五痰培養(yǎng)真菌、鏈球菌菌落形態(tài)第49頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細菌的初步分類細菌的分離與純化：自血平板挑出待檢菌株的單菌落進行初步的鑒定。如果混有雜菌，應(yīng)該重新轉(zhuǎn)種分純。染色與鏡檢：首先通過革蘭氏染色確定基本的分類：（1）G+球菌（2）G-球菌（3）G-桿菌（4）G+桿菌。此外，如果鏡下發(fā)現(xiàn)革蘭氏染色陽性、橢圓形、有芽孢狀的較大菌體，可能是真菌。第50頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五細菌的初步分類觸酶試驗

主要用于G+球菌的分類。葡萄球菌屬（微球菌屬）：觸酶（+），鏈球菌屬及腸球菌：觸酶（-）氧化發(fā)酵試驗（O/F試驗）根據(jù)細菌在無氧環(huán)境中能否利用碳源將細菌分為非發(fā)酵菌(O/F陰性)和發(fā)酵菌（O/F陽性）氧化酶試驗：腸桿菌的氧化酶（-），非發(fā)酵菌多數(shù)氧化酶（+），但嗜麥芽窄食單胞菌和不動桿菌的氧化酶（-），弧菌科氧化酶（+）第51頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五G-桿菌的鑒定途徑G染色G-b

O/F試驗和氧化酶（ox)試驗

OF（-）

OF（+）

OF（+）ox（+）

ox（-）

ox（+）

非發(fā)酵型細菌腸桿菌科

弧菌科第52頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五G-桿菌ATB細菌鑒定系統(tǒng)腸桿菌科、弧菌科ID32E腸桿菌科鑒定條ATBG-5腸桿菌科藥敏試條非發(fā)酵菌ID32GN非發(fā)酵菌鑒定條ATBPSE5非發(fā)酵菌藥敏試條

第53頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五2023/3/654革蘭陰性鑒定及藥敏試條第54頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五血清學(xué)試驗?zāi)c道致病菌生化特征符合的前提下必須有血清學(xué)的試驗作最后確認：

1.志賀氏菌多價和單價凝集血清2.沙門氏菌多價和單價凝集血清3.致病性大腸桿菌多價和單價凝結(jié)血清4.

耶爾森氏菌凝集血清第55頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五G+球菌的鑒定途徑1.首先根據(jù)菌落特點和革蘭氏染色判斷是否為G+球菌。2.根據(jù)觸酶結(jié)果判斷為葡萄球菌（微球菌屬）or鏈球菌（腸球菌）3.葡萄球菌屬：觸酶（+）鏈球菌屬及腸球菌：觸酶（-）第56頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五G+球菌的鑒定途徑葡萄球菌屬：觸酶（+）、氧化酶（-）、

O-F試驗：發(fā)酵型

微球菌屬：觸酶（+）、氧化酶（+）、

O-F試驗：氧化型第57頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五金黃色葡萄球菌最重要的致病葡萄球菌血平板上菌落有明顯β溶血環(huán)，顏色呈金黃色、灰白色或檸檬色分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和甘露醇血漿凝固酶和DNA酶陽性

第58頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第59頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五2023/3/660葡萄球菌第60頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五ATB細菌鑒定系統(tǒng)葡萄球菌：ID32STAPH葡萄球菌鑒定條ATBSTAPH5葡萄球菌藥敏試條第61頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五2023/3/662葡萄球菌鑒定、藥敏試條第62頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五鏈球菌鑒定途徑鏈球菌屬:觸酶（-）、七葉苷（-）、6.5%NaCl（-）

腸球菌：觸酶（-）、七葉苷（+）、6.5%NaCl（+）第63頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五鏈球菌鑒定途徑根據(jù)G染色和觸酶結(jié)果確定為鏈球菌，然后再根據(jù)細菌的溶血情況和菌落特點判斷鑒定途徑第64頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五鏈球菌鑒定途徑根據(jù)G染色和觸酶結(jié)果確定為鏈球菌，然后再根據(jù)細菌的溶血情況和菌落特點判斷鑒定途徑第65頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第66頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五鏈球菌鑒定途徑

α溶血

Optochin

R

S

+膽汁七葉苷--

肺炎鏈球菌

D群鏈球菌

草綠色鏈球菌

第67頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第68頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五鏈球菌鑒定途徑

β溶血

桿菌肽CAMP膽汁七葉苷

S

+

+

A群鏈球菌

B群鏈球菌

D群鏈球菌6.5%NaCl--+

非腸球菌腸球菌第69頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第70頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五鏈球菌鑒定途徑

γ溶血

膽汁七葉苷

+--D群鏈球菌草綠色鏈球菌-6.5%NaCl+非腸球菌腸球菌

第71頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五ATB細菌鑒定系統(tǒng)鏈球菌：RapidID32STREP鏈球菌鑒定條ATBSTREP5鏈球菌藥敏試條

腸球菌：RapidID32STREP鏈球菌鑒定條ATBEnteroc5腸球菌藥敏試條第72頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五G-桿菌的鑒定途徑G染色G-b

O/F試驗和氧化酶（ox)試驗

OF（-）

OF（+）

OF（+）ox（+）

ox（-）

ox（+）

非發(fā)酵型細菌腸桿菌科

弧菌科第73頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五ATB細菌鑒定系統(tǒng)腸桿菌科、弧菌科ID32E腸桿菌科鑒定條ATBG-5腸桿菌科藥敏試條非發(fā)酵菌ID32GN非發(fā)酵菌鑒定條ATBPSE5非發(fā)酵菌藥敏試條

第74頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五真菌的鑒定途徑沙包氏培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基革蘭氏染色：陽性、橢圓形、有芽孢狀的較大菌體通過血清芽管形成試驗鑒定出白念珠菌CSF標本通過墨汁染色可以初步判斷為新型隱球菌第75頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第76頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五ATB細菌鑒定系統(tǒng)酵母樣真菌：ID32C酵母菌鑒定條ATBFUNGUS3酵母菌藥敏條第77頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五嗜血桿菌的鑒定途徑只能在營養(yǎng)條件高的巧克力平板上生長，菌落為中等大小、圓形、灰白色、透明革蘭染色：G-小桿菌衛(wèi)星實驗就可以幫助初步鑒定第78頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五2023/3/679嗜血桿菌第79頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五第80頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五ATB細菌鑒定系統(tǒng)嗜血桿菌：

APINH嗜血桿菌鑒定條

ATBHAEMO嗜血桿菌藥敏試條第81頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五奈瑟氏菌屬鑒定在血平板和巧克力平板上生長，mac上不生長血平板形成灰色、濕潤、透明或半透明、不溶血的菌落巧克力平板上形成圓形、灰藍色的似露滴狀菌落革蘭染色：G-雙球菌，呈腎形或咖啡豆形，凹面相對氧化酶和觸酶都均為陽性第82頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五

奈瑟氏菌屬有11個種，臨床就淋病奈

菌和腦膜炎奈瑟菌最為重要第83頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五奈瑟氏菌屬鑒定流程

菌落觀察：灰色、濕潤、透明或半透明、不溶血

涂片染色：G-雙球菌，呈腎形或咖啡豆?fàn)?/p>

氧化酶試驗+觸酶+

+麥芽糖--

腦膜炎奈瑟菌

淋病奈瑟菌第84頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五莫拉菌有4個種，僅卡他莫拉菌對人類有致病性莫拉菌屬第85頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五卡他莫拉菌鑒定在血平板和巧克力平板上生長，mac上不生長血平板形成灰白色或紅棕色、不溶血的菌落，培養(yǎng)48小時，菌落表面干燥，接種環(huán)可推移整個菌落且不粘環(huán)革蘭染色：G-雙球菌，呈咖啡豆形氧化酶和觸酶都為陽性第86頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五卡他莫拉菌鑒定流程

菌落觀察：灰白色或紅棕色、光滑、不溶血、干燥

涂片染色：G-雙球菌，呈腎形或咖啡豆?fàn)钛趸冈囼?觸酶++DNAM酶

--

卡他莫拉菌其他奈瑟氏菌

第87頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五奈瑟氏菌屬與相似菌鑒別的關(guān)鍵性試驗

葡萄糖麥芽糖蔗糖硝酸鹽還原DNA酶淋病奈瑟菌+--

------腦膜炎奈瑟菌++------

卡他莫拉菌

------++

第88頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五ATB細菌鑒定系統(tǒng)

奈瑟氏菌屬和莫拉菌鑒定和藥敏試條同

嗜血桿菌

第89頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五需氧G+b的鑒定途徑根據(jù)抗酸染色（A）將其分為：

A+：分枝桿菌、奴卡氏菌

A-：李斯特菌屬，芽胞桿菌屬、棒狀桿菌屬、乳酸桿菌屬、丹毒絲菌屬等第90頁，共107頁，2023年，2月20日，星期五需氧G+b的鑒定途徑屬間鑒定，通過觸酶和動力試驗加以初步確定

觸酶（+）

+

動力

-

李斯特菌屬