分子生物學(xué)呂社民轉(zhuǎn)基因生物與基因打靶

分子生物學(xué)呂社民轉(zhuǎn)基因生物與基因打靶第1頁/共35頁第一節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

transgenicanimal概念:指用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi)，并能穩(wěn)定傳代的一類動(dòng)物。特點(diǎn)：分子及細(xì)胞水平的操作，組織和整體水平的表達(dá)。目的：培育新種，獲取人類所需的生物產(chǎn)品，或進(jìn)行基因功能的研究。第2頁/共35頁

轉(zhuǎn)基因研究大事記

1974年，美國學(xué)者Jaenisch應(yīng)用顯微鏡注射法把基因?qū)胝婧思?xì)胞。1981年，美國科學(xué)家將外源基因?qū)雱?dòng)物胚胎，創(chuàng)立了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)。1982年獲得轉(zhuǎn)基因小鼠。1987年，世界上第一只商業(yè)化轉(zhuǎn)基因綿羊在英國著名的羅斯林研究所誕生。這只轉(zhuǎn)基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶。1989年，意大利學(xué)者用精子作為載體，成功地獲得了純系轉(zhuǎn)基因小鼠。

第3頁/共35頁第4頁/共35頁1997年2月，英國羅斯林研究所維爾穆特博士科研組公布體細(xì)胞克隆羊“多利”培育成功。1997年10月，英國羅斯林研究所宣布已克隆出3只攜帶有人凝血因子Ⅸ基因轉(zhuǎn)染綿羊。1999年2月，上海遺傳研究所宣布轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀闭Q生，其體內(nèi)被檢測(cè)到帶有人的血清白蛋白基因，這項(xiàng)成果被評(píng)為當(dāng)年“中國十大科技進(jìn)展”之一。2000年6月22日晚8時(shí)整，生物胚胎工程專家張涌教授在西北農(nóng)林科技大學(xué)種羊場(chǎng)順利接生了一只雌性體細(xì)胞克隆山羊陽陽。第5頁/共35頁談家楨院士（左）、著名老中醫(yī)徐蔚霖教授（右），曾溢滔院士（中），轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀钡?頁/共35頁第7頁/共35頁思考題轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備應(yīng)包括那些環(huán)節(jié)？制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可能會(huì)遇到哪些問題？你認(rèn)為可采用哪些方法去解決？第8頁/共35頁三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物建立流程

1、待轉(zhuǎn)移的目的基因的獲得與設(shè)計(jì)

2、動(dòng)物遺傳背景及種系的選擇在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究時(shí)要考慮遺傳背景及種系的問題。

第9頁/共35頁3、常用的細(xì)胞

1）受精卵：受精卵→基因操作→注射假孕動(dòng)物子宮→胚胎→個(gè)體。

2）胚胎干細(xì)胞：從著床前的動(dòng)物胚胎中分離多功能胚胎干細(xì)胞→基因操作→注射入動(dòng)物囊胚→形成嵌合體胚胎→嵌合個(gè)體。

第10頁/共35頁5、導(dǎo)入基因顯微注射法：用顯微注射儀將外源基因直接注射入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受精卵中，利用外源基因整合到DNA中，從而得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。特點(diǎn)：導(dǎo)入速度快，操作簡單，對(duì)DNA大小無限制，不需要載體，整合效率較高，它可以直接獲得純系。缺點(diǎn)：需要貴重精密儀器，技術(shù)操作較難，并且外源基因的整合位點(diǎn)和整合的拷貝數(shù)都無法控制，易造成宿主動(dòng)物基因組的插入突變，引起相應(yīng)的性狀改變，重則致死第11頁/共35頁逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法：將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高濃度的病毒顆粒，人為感染著床前或著床后的胚胎，也可以直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細(xì)胞共孵育以達(dá)到感染的目的，通過病毒將外源目的基因插入整合到宿主基因組DNA中去。特點(diǎn)：用于分裂后的早期胚胎，特別適于禽類的轉(zhuǎn)基因研究。單點(diǎn)單拷貝插入，外源基因的完整性不易被破壞。精子載體法：經(jīng)電穿孔等方法把外源基因?qū)刖?，令其與卵子結(jié)合，受精。第12頁/共35頁6、接受外源基因的個(gè)體的產(chǎn)生1）受精卵：受精卵→基因操作→注射假孕動(dòng)物子宮→胚胎→個(gè)體。

2）胚胎干細(xì)胞：從著床前的動(dòng)物胚胎中分離多功能胚胎干細(xì)胞→基因操作→注射入動(dòng)物囊胚→形成嵌合體胚胎→嵌合個(gè)體第13頁/共35頁第14頁/共35頁

5．轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立建立鼠系第15頁/共35頁轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中外源DNA的檢測(cè)染色體和基因水平：分離基因組DNA，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，Southern雜交和PCR分析，原位雜交等以評(píng)估外源基因的整合情況。轉(zhuǎn)錄水平：Northern雜交，RT-PCR。蛋白質(zhì)水平：Western印漬分析。第16頁/共35頁動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)面臨著一些問題生產(chǎn)效率低基因整合效率不高生產(chǎn)周期長，成本高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物死亡率高常出現(xiàn)不育導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因難以傳代無法大規(guī)模生產(chǎn)第17頁/共35頁轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物一、轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)是轉(zhuǎn)基因技術(shù)和動(dòng)物克隆技術(shù)的有機(jī)結(jié)合。它以轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核供體，采用體細(xì)胞核移植技術(shù)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物，實(shí)現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新。

二、轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù)顯示出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)：

1、生產(chǎn)效率高

2、周期短，成本低

3、可以決定后代性別第18頁/共35頁轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的應(yīng)用研究不同發(fā)育階段基因組織和功能，細(xì)胞發(fā)育的潛能性，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的相互關(guān)系，胚胎發(fā)育調(diào)控，腫瘤，神經(jīng)與發(fā)育等。

動(dòng)物新品種的培育構(gòu)建醫(yī)用或食用蛋白的反應(yīng)器用于疾病相關(guān)的研究及建立疾病的動(dòng)物模型可作為器官移植的供體第19頁/共35頁第二節(jié)轉(zhuǎn)基因植物概念:指用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi)，并能穩(wěn)定傳代的一類植物。方法：獲取目的基因→受體細(xì)胞培養(yǎng)→將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（載體直接轉(zhuǎn)化或先轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，后者再轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞）→培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞→篩選陽性細(xì)胞→培植陽性植株→轉(zhuǎn)基因植株的鑒定另外，也有用病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，電擊法，基因槍法，顯微注射，脂質(zhì)體介導(dǎo)法，多聚物介導(dǎo)法，激光束穿孔法等第20頁/共35頁轉(zhuǎn)基因植物實(shí)際上，可以被看作生物制備器，主要用于：生產(chǎn)藥物蛋白制備口服疫苗獲得品質(zhì)更好的中藥材獲得新的農(nóng)作物品種：抗蟲棉花，抗旱小麥等轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用第21頁/共35頁基因打靶

genetargeting第22頁/共35頁一、概述：基因打靶是利用DNA同源重組原理，在基因組中的某一特定部位進(jìn)行定點(diǎn)的基因重組，是研究基因的功能的有效手段。包括基因敲除（geneknockout）和基因敲入（geneknockin）。第23頁/共35頁同源重組的分子過程1、兩段較長的同源DNA或同源染色體彼此靠攏，在二條相同極性上斷裂2、產(chǎn)生交叉結(jié)構(gòu)3、在交叉處橫斷內(nèi)切，產(chǎn)生4種含有異源雙鏈的重組產(chǎn)物第24頁/共35頁第25頁/共35頁二、基因敲除的基本程序1、構(gòu)建打靶載體

1）同源序列

2）打靶載體常含兩種篩選標(biāo)志

neor：新霉素抗性基因，陽性篩選標(biāo)志，neor基因插入用于打靶的外源DNA中，當(dāng)重組后，細(xì)胞能在含新霉素的培養(yǎng)基中生長。neorHSV-tk第26頁/共35頁HSV-tk：單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，陰性篩選標(biāo)志，該基因產(chǎn)物可分解單核苷酸類似物而生成毒性產(chǎn)物，產(chǎn)生自殺效果。

HSV-tk基因插入外源基因外側(cè)的載體序列中。同源重組時(shí)，Tk-基因往往丟失；隨機(jī)整合時(shí)，Tk-基因連同打靶載體整合到核基因組上，而同時(shí)獲得neo和HSV-tk兩個(gè)基因的打靶細(xì)胞。第27頁/共35頁啟動(dòng)子HSV-TK同源序列同源序列Neo第28頁/共35頁2、將載體導(dǎo)入ES細(xì)胞選取發(fā)育第4-5天的胚胎干細(xì)胞(ES)

。把外來基因轉(zhuǎn)入胚胎肝細(xì)胞。并篩選打靶成功的細(xì)胞。第29頁/共35頁隨機(jī)整合同源重組第30頁/共35頁3、將基因敲除ES細(xì)胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎。4、將10-20個(gè)胚泡植入假孕小鼠子宮。5、獲得子代小鼠，篩選帶有靶基因的小鼠。常有的方法有：Southern印記、Northern印記把胚胎注入假孕小鼠Southern印記把細(xì)胞注入胚泡第31頁/共35頁6、雜和小鼠（+/-）間雜交，獲得子二代小鼠（+/+、-/-、+/-）。7、篩選的-/-、+/-子二代小鼠。（+/-）（+/-）（+/-）（-/-）（+/+）（+/-）（+/-）（+/-）（+/-）（+/+）（-/-）第32頁/共35頁三、基因打靶在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用1、采用基因打靶技術(shù)可建立基因缺陷型的疾病模型，用于研究遺傳疾病發(fā)生的分子機(jī)制。2、基因打靶與腫瘤的研究研究基因改變與腫瘤發(fā)生及治療的關(guān)系3、基因打靶可用于構(gòu)建高效的動(dòng)物反應(yīng)器或植物反應(yīng)器，用于藥物生產(chǎn)。第33頁/共35頁小結(jié)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是在基因重組基礎(chǔ)上建立新的多細(xì)胞真核生物的方法。這是一個(gè)具有重大意義的革命性的突破。它為我們培育新的物種提供了新的思路，為我們研究基因的功能，研究疾病發(fā)生的機(jī)理提供了有力的手段。