用于檢測(cè)和定量分析極性細(xì)胞代謝物的一種新穎的HILICLCMS方法

/用于檢測(cè)和定量分析極性細(xì)胞代謝物的一種新穎的HIＬICLC—MS方法來(lái)源：沃特世公司閱讀數(shù)：61時(shí)間:2０11—04－20引言復(fù)雜生物樣品通常包含大量可反映有機(jī)體代謝狀態(tài)的內(nèi)源性代謝物.特別是骨骼肌可根據(jù)其是快收縮肌(白色肌肉,糖酵解型）還是慢收縮肌（紅色肌肉，氧化型)而表現(xiàn)出特征性的代謝組“指紋圖譜"。例如，紅色肌肉應(yīng)顯示一種富含線(xiàn)粒體代謝物(如三羧酸循環(huán))的代謝組指紋圖譜；而白色肌肉應(yīng)顯示富含糖酵解代謝物的代謝組指紋圖譜，其線(xiàn)粒體代謝物的濃度大大低于紅色肌肉。雖然很多這類(lèi)代謝物可具有較強(qiáng)的極性，但這些樣本通常使用反相液相色譜－質(zhì)譜(ＲP-LC—MS)進(jìn)行分析，由此而來(lái)的多是較差的保留。在本研究中，我們開(kāi)發(fā)了一種用于檢測(cè)和定量強(qiáng)極性細(xì)胞代謝物的新穎LC—ＭＳ方法.本研究采用了基于亞２微米顆粒BEＨ酰胺柱的親水作用液相色譜（ＨILＩC），并聯(lián)用了雜化四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀和三重四極桿質(zhì)譜。方法這些試驗(yàn)借助聯(lián)用了沃特世SyｎaptＴMＨＤMSTM、沃特世SynaｐｔG2HＤMS和XeｖoTQ的一臺(tái)UPLC系統(tǒng)而進(jìn)行：液相色譜條件（1）：使用堿性流動(dòng)相液相色譜系統(tǒng)：沃特世AＣＱＵITYUPLC?系統(tǒng)－色譜柱：AＣQUITYUPＬＣＢEHAmidｅ酰胺基柱，2.1×１00mｍ，1。7μm-柱溫：４5℃－流速：50０μＬ/分鐘－堿性流動(dòng)相Ａ：乙腈／水,9５/5(ｖ／v)，1０ｍM醋酸銨,ｐH=9.０—堿性流動(dòng)相B：乙腈／水，50/50(ｖ/v），1０ｍM醋酸銨，pＨ＝９。0－梯度（采用堿性流動(dòng)相進(jìn)行分離時(shí)）：線(xiàn)性梯度，先用2%Ｂ－85％B洗脫8分鐘,然后在９8％B的水平下保持２分鐘，接著返回到2%B的水平進(jìn)行再平衡(5分鐘)-進(jìn)樣量:５—20μL液相色譜條件(２):使用酸性流動(dòng)相液相色譜系統(tǒng):沃特世?ＡＣQUＩTＹUPLC?系統(tǒng)－色譜柱：AＣＱＵＩＴYUPＬCBEHＡｍidｅ酰胺基柱，2．1×100mm，1。７μm—柱溫：40℃－流速:６00μL/分鐘—酸性流動(dòng)相A：乙腈／水，９5/5(v/ｖ），10ｍM醋酸銨,ｐＨ=3．０－酸性流動(dòng)相B：水，10mM醋酸銨，ｐH=3。0－梯度：先用５％B-30%B洗脫５分鐘，在第5．5min時(shí)升至６０％B并保持7分鐘,接著返回到5％Ｂ的水平進(jìn)行再平衡（5分鐘)－進(jìn)樣量：２０μL滿(mǎn)定量環(huán)質(zhì)譜分析SyｎaptHDMS和ＳynａptＧ2ＨDMS該質(zhì)譜儀在正離子MSE模式下運(yùn)行。所用的毛細(xì)管電壓為3。0kV,源溫度和去溶劑化溫度分別被設(shè)定為120℃和400℃。在MSE采集模式下，儀器交替在低、高碰撞能量狀態(tài)下進(jìn)行交替掃描。這樣可在一次分析內(nèi)同時(shí)收集所有分析物的母離子和碎片離子的信息，消除了諸如DDA等其它常規(guī)方法所帶來(lái)的采樣偏差；在常規(guī)方法中，特定的ｍ／z必須在碎片化前被分離出來(lái).Ｘｅvo－TＱ質(zhì)譜XevｏTQ可同時(shí)在正離子和負(fù)離子模式下運(yùn)行。毛細(xì)管電壓為3。０kV，源溫度和去溶劑化溫度分別被設(shè)定為1５０℃和65０℃。去溶劑化氣體流速被設(shè)定為12０0Ｌ／小時(shí),碰撞氣體（氬)的流速為0.18mＬ/分鐘（４×1０—3毫巴）。ＭＳ1/MＳ2分辨率被設(shè)置為單位質(zhì)量（0。7５DaFWHM)。組織提取物的樣品制備紅色的比目魚(yú)肌(S）用來(lái)與白色的腓腸肌(G）進(jìn)行比較，肌肉從禁食一整夜的BALB／c小鼠中切下并進(jìn)行了急速冷凍。代謝物通過(guò)組織均質(zhì)化的方法在１:１的甲醇:水混合溶劑中進(jìn)行萃取,脂質(zhì)通過(guò)將氯仿以1:１的比例添加至甲醇/水萃取液中而得到去除。去脂質(zhì)后的組織萃取樣本分別用400μＬ和40０0μL的90:１0乙腈:水混合溶劑進(jìn)行揮干復(fù)溶。由于某些組分的含量高于定量上限,因此也對(duì)每份樣本再稀釋?zhuān)?倍進(jìn)行了分析.結(jié)果和討論1.通過(guò)聯(lián)用SynaptHDMS的UPLC進(jìn)行HILICLC—MS方法開(kāi)發(fā)圖１.108種標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)極性細(xì)胞代謝物的總離子色譜圖，其中包括氨基酸、DNA／RNＡ堿基及其磷酸鹽、輔酶A、B族維生素、有機(jī)酸等。圖1給出了1０8種標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)極性細(xì)胞代謝物的總離子色譜圖(TIC)，其中包括氨基酸、DＮA/ＲNＡ堿基及其磷酸鹽、輔酶A、B族維生素、有機(jī)酸等。此項(xiàng)試驗(yàn)通過(guò)聯(lián)用沃特世SynaptＨDＭS（正離子MSE模式下）的沃特世UPLC【液相色譜條件（１)】而進(jìn)行。2.使用UPLC／Xeｖo-ＴQ聯(lián)用儀器對(duì)HIＬICLC-ＭS方法開(kāi)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞萃取物進(jìn)行定量分析在UＰＬC優(yōu)化過(guò)程中進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)品分析表明使用酸性pH的流動(dòng)相緩沖液可提高對(duì)氨基酸和有機(jī)酸的分辨率、信噪比和峰對(duì)稱(chēng)性。圖３比較了對(duì)一種包含約2μg/mＬL—賴(lài)氨酸的純氨基酸溶液所得出的兩幅MRＭ色譜圖?？可系纳V圖通過(guò)使用堿性流動(dòng)相(液相色譜條件1）所進(jìn)行的分離而得出,而靠下的色譜圖則采用酸性流動(dòng)相（液相色譜條件２）。圖3。比較不同pＨ下,包含約2μg/mLL－賴(lài)氨酸溶液的兩幅MRM色譜圖圖4.液相色譜條件（2）得出的MＲM色譜圖示例圖4將酸性流動(dòng)相（液相色譜條件(２)）下160０ng/mＬ校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品(上圖）和樣本H—Ｓ（0090)的MRＭ色譜圖進(jìn)行了疊加.在此條件下,我們成功分離并定量分析了２8種化合物，其中包括氨基酸、有機(jī)酸和磷酸鹽(圖6)。圖５．TargeｔＬyｎx給出的ADP電子報(bào)告示例４3種化合物的定量分析（既包括酸性也包括堿性條件）使用TａrgeｔＬynxTM進(jìn)行.對(duì)于每種化合物，均生成了相應(yīng)的電子報(bào)告;計(jì)算結(jié)果通過(guò)線(xiàn)性回歸進(jìn)行確定。圖５是腺苷二磷酸(ADP，在三羧酸循環(huán)中特別重要)的一個(gè)報(bào)告示例。圖6。使用堿性（左表)和酸性（右表)流動(dòng)相在H—S和H—G組織樣本中所檢出化合物的濃度計(jì)算結(jié)果總合對(duì)在堿性和酸性流動(dòng)相分離中所檢出的Ｈ-Ｓ和Ｈ—Ｇ組織樣本中的每種化合物均計(jì)算了分析物濃度。通過(guò)比較紅色比目魚(yú)?。ǎ樱┖碗枘c肌(G）組織樣本中的代謝物濃度證實(shí)了在其相對(duì)濃度方面存在顯著差異。3.通過(guò)聯(lián)用SｙｎaptＧ2的UＰLC對(duì)HILIＣＬC－ＭS方法的標(biāo)準(zhǔn)品和細(xì)胞萃取物進(jìn)行定量分析最近開(kāi)發(fā)的用于SｙnａptG2的QｕanToｆ技術(shù)[１]以及MSE數(shù)據(jù)采集技術(shù)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了一種通用型UＰLC-MＳ方法的開(kāi)發(fā)；這種方法可在一次運(yùn)行分析得到提供所有物質(zhì)的定量和定性信息，既包括母離子信息也包括產(chǎn)物離子的信息。對(duì)于此項(xiàng)測(cè)定而言,系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品以及Ｈ－S和H—G樣本的數(shù)據(jù)都進(jìn)行了采集(圖7）,所有的數(shù)據(jù)處理工作在采集完成后進(jìn)行.圖7。全掃描色譜圖比較。通過(guò)UPLC—SｙnaptG2獲取的Ｓ和G細(xì)胞萃取物的數(shù)據(jù).圖8．目標(biāo)化合物的鑒定和定量結(jié)果首先,自動(dòng)篩選細(xì)胞萃取物中是否存在目標(biāo)化合物。離子的鑒定和確認(rèn)通過(guò)一個(gè)單一處理步驟使用Ｐｏｓit±veTM軟件包得出母離子和子離子的準(zhǔn)確質(zhì)量（2mDａ窗口）而實(shí)現(xiàn)(圖8）。該數(shù)據(jù)表明與ＸｅvoTQ分析結(jié)果具有良好的一致性。圖8給出了一個(gè)示例,化合物L(fēng)-脯氨酸在細(xì)胞萃取物中被明確鑒別出來(lái)，并在４個(gè)數(shù)量級(jí)中表現(xiàn)出線(xiàn)性的動(dòng)態(tài)范圍響應(yīng),RMS質(zhì)量誤差為0．5７ｍDa。結(jié)論l使用新型ＢＥHAmide酰胺柱可開(kāi)發(fā)出一種用于分離極性組織細(xì)胞代謝物的HILICＬC-MS方法，總運(yùn)行時(shí)間不到15分鐘.l同時(shí)采用XevｏTQ和SynaｐtG2HＤＭS對(duì)紅色和白色的肌肉組織萃取物進(jìn)行定量分析，可明顯區(qū)分出其主要代謝物(比如AMP、ADP和ＡTP、以及瓜氨酸）