培養(yǎng)細(xì)胞的觀察和檢測(cè)

培養(yǎng)細(xì)胞的觀察和檢測(cè)第1頁(yè)/共25頁(yè)一、培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)觀察細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中需要每天進(jìn)行常規(guī)檢查和顯微鏡觀察，及時(shí)了解細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、數(shù)量改變、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞有無(wú)移動(dòng)、有無(wú)污染、培養(yǎng)液pH是否變酸、變黃是否更換等。細(xì)胞常規(guī)檢查觀察的內(nèi)容為：

第2頁(yè)/共25頁(yè)1、培養(yǎng)液培養(yǎng)液的顏色和透明度的變化正常情況下，培養(yǎng)液pH介于7.2～7.4之間，呈桃紅色清亮透明。隨著細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞代謝產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物會(huì)使培養(yǎng)液pH值下降，引起顏色變淺變黃。正常情況生長(zhǎng)穩(wěn)定的細(xì)胞2～3天換液一次，生長(zhǎng)緩慢的細(xì)胞3～4天換液一次。第3頁(yè)/共25頁(yè)培養(yǎng)液中加Hepes或用5%CO2溫箱培養(yǎng)可使pH維持穩(wěn)定，利于細(xì)胞生長(zhǎng)。用含磷酸鹽緩沖系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)，可因瓶及塞子漏氣，CO2溢出，也可能由于培養(yǎng)瓶塞洗刷不潔、殘留堿性物，使培養(yǎng)液變堿發(fā)紅，只致使細(xì)胞難以生長(zhǎng)，甚至死亡。細(xì)胞換液傳代后，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液很快變黃，要注意是否有細(xì)菌污染或培養(yǎng)器皿沒(méi)有洗干凈。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)若出現(xiàn)混濁，多為污染。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，應(yīng)將瓶豎起靜置1小時(shí)，若培養(yǎng)基混濁示為污染，也可在顯微鏡下仔細(xì)觀察有無(wú)污染現(xiàn)象出現(xiàn)。

第4頁(yè)/共25頁(yè)2、細(xì)胞生長(zhǎng)情況生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，在顯微鏡下可觀察到細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清。若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良，可見(jiàn)細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折光性變?nèi)?，?xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙增大，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落，有時(shí)細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。第5頁(yè)/共25頁(yè)若細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良狀況沒(méi)有得到及時(shí)糾正，進(jìn)一步發(fā)展可見(jiàn)到部分細(xì)胞死亡，崩解漂浮在培養(yǎng)液中。發(fā)現(xiàn)這種情況應(yīng)及時(shí)處理，只有生長(zhǎng)良好的細(xì)胞才能進(jìn)行傳代培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)研究。

第6頁(yè)/共25頁(yè)3細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)初代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)，都有一長(zhǎng)短不同的潛伏期，在培養(yǎng)過(guò)程中注意觀察細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的狀態(tài)極為重要。各種細(xì)胞增殖的時(shí)間不盡一致。傳代細(xì)胞系，胚胎組織或幼體細(xì)胞潛伏期短，一般在接種培養(yǎng)第二天即可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，3～4天便可連接成片。成體組織的潛伏期長(zhǎng)，老年組織和癌組織潛伏期更長(zhǎng)，可達(dá)一周左右。第7頁(yè)/共25頁(yè)原代細(xì)胞培養(yǎng)中最先可見(jiàn)從組織塊中邊緣“長(zhǎng)出”細(xì)胞，這種細(xì)胞是從原代組織塊中游走出來(lái)的，并不是細(xì)胞增殖產(chǎn)生。這種早期游出的細(xì)胞多以成纖維細(xì)胞為主，其易生長(zhǎng)，適應(yīng)性強(qiáng)，呈放射狀或旋渦狀分布，很快生長(zhǎng)并互相連接成網(wǎng)狀。傳代細(xì)胞在傳代后，一般經(jīng)過(guò)懸浮、貼壁伸展很快進(jìn)入潛伏期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞大量繁殖，逐漸相連成片而長(zhǎng)滿瓶底。一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%就應(yīng)及時(shí)傳代，否則會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)甚至脫落。懸浮細(xì)胞當(dāng)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)顯著、密度增大、分布稠密、培養(yǎng)液變黃時(shí)也應(yīng)及時(shí)傳代。

第8頁(yè)/共25頁(yè)4、微生物污染

細(xì)胞接種、傳代、換液加藥后應(yīng)經(jīng)常觀察，密切注意是否有微生物污染發(fā)生。一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液混濁、液體內(nèi)漂浮著菌絲或細(xì)菌，或生長(zhǎng)明顯變緩，胞質(zhì)內(nèi)顆粒增多，有中毒表現(xiàn)等應(yīng)懷疑是否有微生物污染，進(jìn)一步觀察檢查并及時(shí)處理。

第9頁(yè)/共25頁(yè)二、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定生長(zhǎng)曲線是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過(guò)短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過(guò)長(zhǎng)短不同的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長(zhǎng)期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長(zhǎng)，進(jìn)入平頂期，然后退化衰亡。為了準(zhǔn)確描述整個(gè)過(guò)程中細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化，需連續(xù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。通常計(jì)數(shù)7d。為精確起見(jiàn)，一般每次計(jì)數(shù)3瓶細(xì)胞并取平均值。典型的生長(zhǎng)曲線可分為生長(zhǎng)緩慢的潛伏期，斜率較大的指教生長(zhǎng)期，呈平臺(tái)狀的平頂期及退化衰亡4個(gè)部分。以存活細(xì)胞數(shù)(萬(wàn)／mL)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間(h或d)作圖，即得生長(zhǎng)曲線。第10頁(yè)/共25頁(yè)除使用計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線外，還可用MTr比色法間接測(cè)量之。MTT比色法的主要原理是：MTr被活細(xì)胞中線粒體琥珀酸脫氫酶還原后，生成暗藍(lán)色甲瓚，甲瓚被助溶劑溶解后，可在酶標(biāo)儀上讀取光吸收值(OD)，在一定范圍內(nèi)光吸收值(OD)與活細(xì)胞數(shù)量呈線性關(guān)系。所以可以通過(guò)測(cè)量OD值，間接測(cè)量活細(xì)胞數(shù)量。生長(zhǎng)曲線常用于測(cè)定藥物等外來(lái)因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的1/3－1/2處加藥。細(xì)胞計(jì)數(shù)的時(shí)間和次數(shù)則依實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。?1頁(yè)/共25頁(yè)三、細(xì)胞培養(yǎng)的污染檢測(cè)及其排除凡混入細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物都應(yīng)視為污染

細(xì)胞污染不能完全被消除，但能減少其發(fā)生的頻率和后果的嚴(yán)重性。

第12頁(yè)/共25頁(yè)細(xì)胞污染的分類

物理污染

化學(xué)污染

生物污染（支原體污染）

控制污染

掌握良好的無(wú)菌操作技術(shù)

建立細(xì)胞庫(kù)

合理應(yīng)用抗生素

保持工作區(qū)清潔

建立良好的規(guī)章制度

檢測(cè)細(xì)胞污染

第13頁(yè)/共25頁(yè)1、污染途徑

空氣：每立方米含菌數(shù)不應(yīng)超過(guò)1－5個(gè)

器材：

操作：

血清：

組織樣本：

第14頁(yè)/共25頁(yè)2、對(duì)細(xì)胞的影響生長(zhǎng)緩慢，分裂相減少，細(xì)胞變粗糙，輪廓增強(qiáng)，胞漿多顆粒狀物。重者細(xì)胞增殖停止，分裂相消失，胞質(zhì)中出現(xiàn)大量堆積物，細(xì)胞變圓或崩解，從瓶壁脫落。

細(xì)胞污染的種類和判定

細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染物有細(xì)菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以下情況時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞可能有污染：

培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變。

培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。

光鏡觀察到菌絲和顆粒。

細(xì)胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢等。

第15頁(yè)/共25頁(yè)3、污染物的檢測(cè)

1）.真菌污染

常見(jiàn)真菌種類：多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等

真菌污染判斷：

肉眼可見(jiàn)培養(yǎng)液中見(jiàn)白色或黃色漂浮物，

倒置鏡下見(jiàn)細(xì)胞間縱橫交錯(cuò)，絲狀、管狀、樹(shù)枝懸浮飄蕩的菌絲或形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)，

培養(yǎng)液多不混濁。第16頁(yè)/共25頁(yè)2）.細(xì)菌污染

常見(jiàn)細(xì)菌種類：大腸桿菌、白色葡萄球菌、假單孢菌等

細(xì)菌污染判斷：

培養(yǎng)液顏色變黃，出現(xiàn)混濁

鏡下觀察，大量圓球狀顆立漂浮，細(xì)胞表面和周圍有大量細(xì)菌

細(xì)胞生長(zhǎng)停止，并有中毒表現(xiàn)

第17頁(yè)/共25頁(yè)細(xì)菌和真菌污染的檢測(cè)：

涂片染色鏡檢；

接種培養(yǎng)：Trypticase大豆肉湯、BHI、Thioglycocollate肉湯和血瓊脂板適于廣泛的細(xì)菌檢測(cè)；Sabouraud肉湯、YM肉湯和營(yíng)養(yǎng)肉湯適于檢測(cè)真菌。

檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果后，應(yīng)高壓滅菌處理污染的培養(yǎng)物及其用具

第18頁(yè)/共25頁(yè)3）.支原體:

常見(jiàn)而棘手。

支原體污染細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)，改變核酸合成，影響細(xì)胞的抗原性，引起細(xì)胞染色體改變，干擾病毒的復(fù)制，以及具有類病毒作用。在培養(yǎng)細(xì)胞初期，由于支原體對(duì)細(xì)胞的繁殖影響較小而往往被忽略。第19頁(yè)/共25頁(yè)支原體檢測(cè)方法和處理：

熒光技術(shù)檢測(cè)：支原體含有DNA，能與熒光染料Hoechest33258特異性的結(jié)合，可根據(jù)細(xì)胞表面的熒光來(lái)顯示細(xì)胞是否污染有支原體。

相差顯微鏡：相差油鏡下呈暗色微小顆粒。

電鏡觀察：SEM，TEM。

DNA分子雜交：檢出率高但復(fù)雜。

檢測(cè)完畢后，所有實(shí)驗(yàn)用具均應(yīng)經(jīng)過(guò)高壓消毒處理。

第20頁(yè)/共25頁(yè)污染支原體后的處理：

抗生素處理：如加入泰樂(lè)菌素等。

共培養(yǎng)法：與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。

重新克隆法：抗生素處理后，將細(xì)胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的新鮮培養(yǎng)液，4-5周后，重復(fù)克隆2次。

過(guò)濾法：0.22µm孔徑濾膜正壓過(guò)濾。

第21頁(yè)/共25頁(yè)4）.污染病毒的檢測(cè)

致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）或集落的檢測(cè)：采用相差顯微鏡檢測(cè)

血細(xì)胞吸附試驗(yàn)；

雞胚接種。第22頁(yè)/共25頁(yè)4、細(xì)胞間交叉污染為避免細(xì)胞間交叉污染，應(yīng)注意：

了解各細(xì)胞系的特征；

培養(yǎng)各細(xì)胞系的操作手續(xù)要快速；

培養(yǎng)各細(xì)胞系不用同一瓶的培養(yǎng)液和酶等；

吸過(guò)培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液的吸管，不能放回儲(chǔ)存培養(yǎng)液和酶的瓶?jī)?nèi)；

經(jīng)常檢查培養(yǎng)物特征，注意任何突然的形態(tài)學(xué)改變，通過(guò)染色體或同工酶譜分析，檢查是否有交叉污染。

第23頁(yè)/共25頁(yè)5、微生物污染的防治