蛋白質(zhì)組學研究方法

第二章蛋白質(zhì)組學研究方法1*當前1頁，總共26頁。

第一節(jié)概述

2*當前2頁，總共26頁。

1.

蛋白質(zhì)組學比基因組學研究復雜蛋白質(zhì)數(shù)目大于基因組數(shù)目，人類基因萬左右，蛋白質(zhì)﹥10萬蛋白質(zhì)是動態(tài)的4種核苷酸-DNA;20氨基酸-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)不能用PCR擴增蛋白質(zhì)不能自動化測序3*當前3頁，總共26頁。DNA分析（cDNAMicroarray）與蛋白質(zhì)分析（2-DE-MS）方法的比較DNA蛋白質(zhì)檢測水平/靈敏度DNA可用PCR擴增蛋白質(zhì)無法被擴增檢測極限約為30copy/transcript檢測方法高度特異性非特異性DNA與互補DNA/RNA的雜交能力蛋白質(zhì)可以用非特異的方法染色或用較特異使DNA和容易固定化在靶上并用的方法如抗體檢測熒光探針檢測，可用高密度列陣熒光掃描儀分子的穩(wěn)定相DNA是非常穩(wěn)定的，即使提高溫度蛋白質(zhì)在變性下將喪失天然功能下也不失去生物活性重復性重復性好重復性不好將DNA固定化在表面已經(jīng)是成熟的由于蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性不好，方法的重復性技術(shù)，加之DNA有固有的穩(wěn)定性，方需格外關(guān)注法的重復性較好消耗初始的投入較大，但短期內(nèi)得到的目前蛋白質(zhì)分析方法依賴昂貴的儀器設(shè)備的數(shù)據(jù)相當大專業(yè)化方法已經(jīng)相當標準分析較難，大部分工作需受過專門訓練的人來操作時間/自動化已成為高通量的掃面技術(shù)目前還達不到工業(yè)化需求的高通量翻譯后修飾無法研究只能用此方法研究動態(tài)5個數(shù)量級7-12個數(shù)量級4*當前4頁，總共26頁。

蛋白質(zhì)分析技術(shù)的發(fā)展2D,IPG,2D-液相色譜圖像分析與數(shù)據(jù)處理技術(shù)生物質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS,ESI-MS)MudPIT（多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)）ICAT（同位素編碼親和標簽技術(shù)）雙色熒光技術(shù)酵母雙雜交Proteinchip5*當前5頁，總共26頁。

樣品組織、細胞、體液膠上原位酶切2-DEMALD/TOF/MS肽指紋圖譜蛋白質(zhì)鑒定ESI/MS/MSPST/MALD/TOF/MS圖像分析，數(shù)據(jù)處理電轉(zhuǎn)印到膜上氨基酸組成N端序列Edman降解氨基酸分析肽混合物肽序列標簽數(shù)據(jù)庫檢索免疫組化蛋白定位蛋白組數(shù)據(jù)庫寡核苷酸合成基因蛋白實驗蛋白活力肽合成抗體蛋白質(zhì)組學分析流程6*當前6頁，總共26頁。第二節(jié)大規(guī)模的蛋白質(zhì)分離技術(shù)7*當前7頁，總共26頁。一、二維凝膠電泳技術(shù)（2D)IEForIPGSDS8*當前8頁，總共26頁。1975年由O’Farrell提出的。是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分離與展示的分離技術(shù)。其原理是在相互垂直的兩個方向上，分別基于蛋白質(zhì)不同的等電點和分子量將蛋白質(zhì)分離開。20世紀80年代初出現(xiàn)固相化pH梯度（IPG)(第一相等點聚焦）。不足之處：膜蛋白，堿性蛋白，低豐度蛋白分離困難。

解決辦法？9*當前9頁，總共26頁。低豐度蛋白：窄范圍pH,加大上樣量，除去高豐度蛋白。BeforeAfterremovalOfalbumin10*當前10頁，總共26頁。2-DEanalysisofnon-fractionatedsoybeanleafproteins(Left)andCa2+/phytatefractionatedsoybeanleafproteins(Right).(Krishnanetal.

(ArapidmethodfordepletionofRubiscofromsoybean(Glycinemax)

leafforproteomicanalysisoflowerabundanceproteins

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Phytochem.2009)11*當前11頁，總共26頁。PEGfractionation:(A)1-DSDSofunfractionatedandfractionatedsamples;(B)2-DEPAGEmapsof‘‘Total’’extractedproteins;(C–E)2-DEmapsofPEGfractions:(C)F1PEGfraction;(D)F2PEGfraction;(E)F3PEGfraction.Electrophoresis2009,30,1594–160212*當前12頁，總共26頁。膜蛋白：分步提取法。CHAPS:zwitterionicdetergentCA:carrierampholyteTBP:TributylphosphineSB3-10:sulfobetaine(detergent)13*當前13頁，總共26頁。pH4 pH5pH5 pH6pH4 pH9堿性蛋白：擴大pH范圍（IPGpH12)14*當前14頁，總共26頁。

高通量與自動化2D/MS為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組技術(shù)體系自動化主要集中在2D后的樣品處理。15*當前15頁，總共26頁。蛋白質(zhì)識別系統(tǒng)的自動化2-DE,染色，凝膠分析膠上蛋白質(zhì)自動切割置于96或384孔板自動蛋白酶解，多肽可回收，點樣于MS樣品靶自動MS樣品分析自動采集數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫檢索，蛋白鑒定16*當前16頁，總共26頁。1.實驗設(shè)計，采樣量2.重復性問題3.動態(tài)范圍4.蛋白質(zhì)的丟失5.通量與自動化問題2D質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學方法的局限性17*當前17頁，總共26頁。二、色譜—質(zhì)譜技術(shù)1．二維色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（2D-HPLC-MS-MS)18*當前18頁，總共26頁。19*當前19頁，總共26頁。2-DE與2D-HPLC的比較優(yōu)點缺點2-DE

分辨率高，﹥1000費時，費力可得到等電點、分子量的信息不已自動化可得到蛋白質(zhì)表達譜疏水、酸性、堿性、﹤10kDa、

可平行多個膠﹥1000kDa的蛋白質(zhì)易丟失

樣品載樣量受限制2D-HPLC

可分離各種蛋白質(zhì)尚未實現(xiàn)平行操作易于自動化不易得到蛋白質(zhì)表達譜樣品在液相分辨率不高流分易收集可做樣品制備和收集20*當前20頁，總共26頁。采用二維色譜—串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以對蛋白質(zhì)混合物進行直接分離與鑒定21*當前21頁，總共26頁。2．同位素標記—親和色譜—質(zhì)譜技術(shù)定量蛋白質(zhì)組學分析技術(shù)Isotope-codedaffinitytag(ICAT)22*當前22頁，總共26頁。三、一維電泳(色譜)—質(zhì)譜技術(shù)23*當前23頁，總共26頁。

1886年Goldstein發(fā)明早期質(zhì)譜儀的離子源，1942年第一臺商品化質(zhì)譜儀出現(xiàn)——分析小分子化合物。20世紀80年代末期的兩項軟電離質(zhì)譜技術(shù)—電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)——分析蛋白質(zhì)。第三節(jié)生物質(zhì)譜蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)MALDI-TOF-MS:高通量，肽指紋圖譜，須數(shù)據(jù)庫匹配。ESI-MS:肽序列標簽，特異性高，混合肽測定，操作繁瑣。新生物質(zhì)譜技術(shù):MALDIQqTOF-MS,MALDI–TOF-TOF-MS24*當前24頁，總共26頁。

Gel-basedproteomicsThetypicalflowofgel-basedproteomics(2DE&MS)Sample