重組人胰島素生產(chǎn)工藝

重組人胰島素生產(chǎn)工藝第一頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日重組人胰島素定義：

胰島素：是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。重組人胰島素（現(xiàn)階段臨床最常使用的胰島素）：利用生物工程技術(shù)，獲得的高純度的生物合成人胰島素，其氨基酸排列順序及生物活性與人體本身的胰島素完全相同。

第二頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日結(jié)構(gòu)：

胰島素由A、B兩個(gè)肽鏈組成。A鏈有11種21個(gè)氨基酸，B鏈有15種30個(gè)氨基酸，共26種51個(gè)氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個(gè)半胱氨酸中的巰基形成兩個(gè)二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來(lái)。此外A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個(gè)二硫鍵。第三頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日3DStructureofInsulin胰島素二聚體（dimer）胰島素六聚體（hexamer

）第四頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日胰島素的性質(zhì)

第五頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日胰島素的功能

胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是唯一同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。藥理作用

治療糖尿病、消耗性疾病。第六頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日胰島素的研究歷史

1921年----從動(dòng)物胰腺中提取出胰島素，開(kāi)創(chuàng)了人類(lèi)胰島素治療的歷史。

1926年----重結(jié)晶胰島素

1930s----傳統(tǒng)中、長(zhǎng)效動(dòng)物胰島素

1970s----單峰胰島素和單組分胰島素

70年代末----半合成胰島素

1982年----采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人胰島素正式上市。90年代至今----重組人胰島素類(lèi)似物成功研發(fā)上市，包括超短效和長(zhǎng)效人胰島素類(lèi)似物。第七頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日胰島素制備工藝

以動(dòng)物胰臟為原料提取胰島素

----酸醇提取法

※傳統(tǒng)胰島素---豬、牛胰臟提取，只經(jīng)一步重結(jié)晶

※單峰胰島素----凝膠過(guò)濾純化

※單組分胰島素---凝膠過(guò)濾、離子交換純化

半合成胰島素----以豬胰島素為原料，酶修飾后得到人胰島素重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人胰島素

※AB鏈合成：分別表達(dá)AB鏈，化學(xué)方法連接

※逆轉(zhuǎn)錄法：表達(dá)胰島素原，酶切得到重組人胰島素第八頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日重組DNA技術(shù)制造人胰島素

AB鏈合成法：以人工合成的人胰島素A鏈和B鏈基因分別與半乳糖苷酶基因連接，形成融和基因，分別在大腸桿菌中表達(dá)A鏈和B鏈，然后再通過(guò)化學(xué)氧化作用，通過(guò)二硫鍵連接起來(lái)?！驯惶蕴诰彭?yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日InsA鏈InsB鏈轉(zhuǎn)化大腸桿菌發(fā)酵A鏈B鏈純化二硫鍵活性胰島素AB鏈合成人胰島素AB鏈合成法第十頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日2.反轉(zhuǎn)錄酶法：仿照天然合成途徑

通過(guò)胰島素原的cDNA合成，表達(dá)產(chǎn)物是胰島素原，經(jīng)工具酶切開(kāi)，除去C-肽得人胰島素。

第十一頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日提取目的基因：既從人的DNA中提取胰島素基因，可使用限制性?xún)?nèi)切酶將目的基因從原DNA中分離。主要有如下4種方法：（1）鳥(niǎo)槍法：用一大堆限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)附近基因進(jìn)行剪切，再提取所需要的。至于如何篩選，用DNA分子雜交，即DNA探針（2）人工合成法：根據(jù)轉(zhuǎn)錄蛋白或者mRNA推導(dǎo)出基因序列，然后人工合成，沒(méi)有內(nèi)含子。（3）從基因文庫(kù)中提?。阂簿褪鞘孪纫呀?jīng)提取完畢的拿來(lái)用（4）PCR擴(kuò)增技術(shù)：用于大量生產(chǎn)該段基因片段，用于商業(yè)化運(yùn)作……

第十二頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日提取質(zhì)粒：使用細(xì)胞工程,培養(yǎng)大腸桿菌，從大腸桿菌的細(xì)胞質(zhì)中提取質(zhì)粒，質(zhì)粒為環(huán)狀。主要有如下2種方法：

（1）堿裂解法：此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增、銀染序列分析。

（2）煮沸法

第十三頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日基因重組：取出目的基因與質(zhì)粒，先利用同種限制性?xún)?nèi)切酶將質(zhì)粒切開(kāi)，再使用DNA連接酶將目的基因與質(zhì)?！翱p合”，形成一個(gè)能表達(dá)出胰島素的DNA質(zhì)粒。第十四頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日將質(zhì)粒送回大腸桿菌：在大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有Ca+的物質(zhì)，如CaCl2,這使細(xì)胞會(huì)吸收外源基因，此時(shí)將重組的質(zhì)粒也放入培養(yǎng)液中，大腸桿菌便會(huì)將重組質(zhì)粒吸收。將大腸桿菌用氯化鈣處理，以增大大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒能夠進(jìn)入受體細(xì)胞，此時(shí)的細(xì)胞處于感受態(tài)（理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來(lái)DNA的生理狀態(tài)）。第十五頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日胰島素的產(chǎn)生：再大腸桿菌內(nèi)，質(zhì)粒通過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄與翻譯后，便產(chǎn)生出胰島素蛋白質(zhì)。通過(guò)大腸桿菌的大量繁衍，便可大量生產(chǎn)出胰島素。（注意：大腸桿菌產(chǎn)出的是多肽鏈，因?yàn)樵松餂](méi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等，不能進(jìn)行多肽的折疊、修飾等，還需人為進(jìn)行菌體外加工。）第十六頁(yè)，共十九頁(yè)，2022年，8月28日質(zhì)粒InsmRNA反轉(zhuǎn)錄InscDNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌PCR連接胰島素原活性胰島素二硫鍵酶切

提取質(zhì)粒限制性?xún)?nèi)切酶酶切

反轉(zhuǎn)錄酶法合成人胰島素第十七頁(yè)，