玻璃化冷凍及質控-ZXY

/玻璃化冷凍技術卵母細胞的玻璃化冷凍及復蘇【適應癥】取卵日丈夫精液和／或睪丸組織中未見可用精子，建議凍存全部卵母細胞;若精子質量極差，可疑受精困難,向患者充分交待病情,知情同意的原則下可考慮凍存部分卵母細胞;取卵日患者獲卵數(shù)>20，自愿凍存部分卵母細胞留待捐贈或自用丈夫患有某些疾患(如梅毒、丙肝潛伏期或感染期、攜帶者）不適宜冷凍胚胎者,如獲卵數(shù)〉1２,建議冷凍部分卵母細胞【冷凍操作流程】1｝簽署卵母細胞冷凍知情同意書2}將玻璃化冷凍液置于室溫下30分鐘后使用，同時準備好冷凍載體、支架,標記清楚；３）將待冷凍的卵母細胞脫顆粒細胞,盡量剝除干凈4)室溫下將２—4枚成熟卵母細胞置于冷凍液１中3－5分鐘，然后迅速轉移至冷凍液2,在1分鐘內將卵母細胞置于冷凍載體上，迅速浸入液氮,裝管，保存。【復蘇操作流程】核對卵母細胞冷凍保存知情同意書，如為捐贈卵母細胞,必須具有贈卵知情同意書；將玻璃化冷凍復蘇液置于室溫下，30分鐘后使用；按照冷凍卡片找到胚胎在液氮罐中的位置，取出冷凍管放入裝有液氮的保溫桶內。確認標本無誤;將冷凍載桿從外套管中取出，將其前端（裝有卵母細胞）浸于wａrｍing液中，顯微鏡下尋找卵母細胞,找到后迅速轉入Ｔ1液中，室溫放置3分鐘,再依次轉入T2，ｗａshing液中各3分鐘,挪入事先準備好的培養(yǎng)滴;3h后行ＩCSI囊胚的玻璃化冷凍及復蘇【冷凍標準】D5或D６,3BB以上囊胚【冷凍操作流程】1｝將囊胚玻璃化冷凍液置于37℃2）37℃下將１—2枚囊胚置于冷凍液1中2分鐘,然后迅速轉移至冷凍液2,在30秒內將【復蘇操作流程】核對囊胚冷凍保存知情同意書；將玻璃化冷凍復蘇液置于3７按照冷凍卡片找到胚胎在液氮罐中的位置，取出冷凍管放入裝有液氮的保溫桶內.確認標本無誤;將冷凍載桿從外套管中取出，將其前端（裝有囊胚）浸于Ｔ１液中,顯微鏡下尋找囊胚,37℃放置２分鐘，再依次轉入T23分鐘，washing液中5分鐘,2h后觀察囊胚擴張情況，評價損傷及移植價值。如2h后仍未擴張建議培養(yǎng)24h再觀察，如仍未擴張，放棄移植。?實驗室質控進入實驗室后檢查記錄實驗室溫度（21-25℃)、濕度（40—６０％）、檢查層流開啟狀態(tài)及培養(yǎng)箱一般情況（溫度３7、ＣO2顯示值５—每日工作結束后必須檢查，填寫每周用CO2檢測儀檢測、核對培養(yǎng)箱CO２濃度(標準?）；核對并記錄培養(yǎng)箱溫度；二周一次對培養(yǎng)箱進行定期消毒,每批次的培養(yǎng)液及耗材必須有到貨時間、使用時間記錄,新批次培養(yǎng)液必須檢測行血氣分析；新耗材、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)液必須經過精子生存實驗５。精子生存實驗

用上游法分離活動性良好的精子。調整活精濃度5-２0×109/L;取0。5ml精子混懸液，置入5ml培養(yǎng)管或培養(yǎng)皿內,做為實驗管，取0.5ml精子混懸液置另一個培養(yǎng)管及培養(yǎng)皿內，做為陰性對照管;將待檢測的各種耗材置于試驗管(皿）內,室溫下放置4天后，用Ｍａｋlｅr計數(shù)器或紅血球計數(shù)器計數(shù)試驗管及對照管內的活動精子，并計算它們之間的生存指數(shù).生存指數(shù)=試驗管內活精/對照管內活精×１0０％如果生存指數(shù)小于7５％，就應考慮可能有細胞毒素的存在。注意：1）４天后陰性對照管精子存活率應大于5０％；2）實驗時可設立陽性對照，即在精子混懸液中加入橡膠手套碎片，培養(yǎng)4天后精子應全部死亡；3）只有陰性對照、陽性對照結果均正常情況下,試驗結果方有效，生存指數(shù)〉75％方可通過；4)如果一次精子生存實驗未通過,應再次重復,３次實驗中至少2次通過方可使用；6。定期檢測實驗室壓差,更換濾膜(初效：1－２月；中效：2－４月；亞高效:1年；高效:3年)7.實驗室新來人員培訓：所有培訓應有記錄，在帶教老師指導下操作?例后,經過實驗室考