凍干流行性乙型腦炎活疫苗制造及檢定規(guī)程

凍干流行性乙型腦炎活疫苗制造及檢定規(guī)程本品系將流行性乙型腦炎（下稱乙腦）SA14-14-2減毒株病毒接種于原代地鼠腎單層細(xì)胞，經(jīng)培育后收獲病毒液，加保護(hù)劑凍干制成。用于預(yù)防乙腦。1毒種1.1毒種來源乙腦SA14-14-2減毒株病毒。由中國藥品生物制品檢定所檢定與分發(fā)。該毒株經(jīng)用乙腦敏感動物試驗(yàn)證明其嗜神經(jīng)毒力減弱，經(jīng)檢查無外源因子存在，用乙腦特異性免疫血清做中和試驗(yàn)證實(shí)為乙腦病毒，并經(jīng)免疫力試驗(yàn)證明具有免疫原性，經(jīng)臨床觀察證明安全有效。1.2生產(chǎn)毒種批制備毒種啟封后，在地鼠腎單層細(xì)胞上增殖傳遞，傳遞代數(shù)不得超過3代。從原始毒種算起，總代數(shù)不是超過10代。在傳代細(xì)胞病變明顯時(shí)收獲病毒液，經(jīng)檢定合格后為生產(chǎn)毒種批。1.3毒種檢定1.3.1無菌試驗(yàn)按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。1.3.2支原體檢查按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。1.3.3病毒滴定抽樣品做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6三個(gè)稀釋度的病毒液，分別接種BHK21細(xì)胞，用蝕斑法進(jìn)行滴定，病毒滴度≥7.2LogPFU/1.0ml為合格。凍干毒種批的滴度≥5.7LogPFU/1.0ml為合格。做病毒滴定同時(shí)應(yīng)用參考苗進(jìn)行滴定，以判斷試驗(yàn)結(jié)果是否成立。1.3.4純毒試驗(yàn)生產(chǎn)毒種批與非同源性乙腦高價(jià)免疫血清混合，置37℃90分鐘，接種地鼠腎單層細(xì)胞或BHK21細(xì)胞進(jìn)行中和試驗(yàn)，觀察5～7天判定結(jié)果。乙腦病毒完全被中和（無細(xì)胞病變或蝕斑出現(xiàn)）為合格，如仍有病變或蝕斑出現(xiàn)，應(yīng)按上述方法再行中和。1.3.5腦內(nèi)致病力試驗(yàn)生產(chǎn)毒種批原液接種體重12～14g小白鼠10只，每只腦內(nèi)注射0.03ml，接種后3天內(nèi)死亡者不計(jì)，觀察14天應(yīng)活存。3天后如有小白鼠發(fā)病，應(yīng)殺死取腦測定致病力，對小白鼠的腦內(nèi)毒力不應(yīng)超過3.0LogLD50/0.03ml，同時(shí)小白鼠皮下注射0.1ml10-1病鼠腦懸液進(jìn)行皮下致病力試驗(yàn)，觀察14天，應(yīng)健存。1.3.6皮下感染人腦試驗(yàn)生產(chǎn)毒種批原液接種體重10～12g小白鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同時(shí)右側(cè)腦內(nèi)空刺，觀察14天，應(yīng)健存。1.3.7乳鼠傳代返祖試驗(yàn)生產(chǎn)毒種批原液接種3～5日齡乳鼠10只，每只腦內(nèi)注射0.02ml。將發(fā)病的乳鼠殺死3只，解剖取腦測其致病力，用體重12～14g小白鼠測定，腦內(nèi)毒力不應(yīng)超過3.0LogLD50/0.03ml，同時(shí)皮下注射10只小白鼠，每只0.1ml10-1乳鼠腦懸液，觀察14天，應(yīng)健存。1.3.8外源因子檢查生產(chǎn)毒種批經(jīng)非同源性乙腦高價(jià)免疫血清中和后，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)。樣品分別接種人二倍體細(xì)胞、BHK21細(xì)胞、原代地鼠腎細(xì)胞，于33～35℃進(jìn)行培育，同時(shí)做對照培育。培育7、14天細(xì)胞應(yīng)無病變，分別進(jìn)行次代培育和血吸附試驗(yàn)；次代培育7、14天時(shí)亦分別觀察細(xì)胞病變和進(jìn)行血吸附試驗(yàn)。結(jié)果均無細(xì)胞病變并血吸附試驗(yàn)陰性為合格。血吸附試驗(yàn)方法：觀察到期的細(xì)胞，用0.2%～0.5%雞、豚鼠紅細(xì)胞混合液于4～8℃、20～25℃中依次進(jìn)行血吸附檢查。所用紅細(xì)胞于2～8℃保存應(yīng)不超過7天。1.3.9細(xì)胞基質(zhì)外源因子檢查制備生產(chǎn)用種子批的細(xì)胞留取5%～10%不種毒，更換相應(yīng)的維持液，置33～35℃培育。在培育7、14天時(shí)，鏡下觀察無細(xì)胞病變后分別做血吸附試驗(yàn)（方法同1.3.8項(xiàng)）。細(xì)胞無病變并血吸附試驗(yàn)陰性為合格。1.4生產(chǎn)毒種批保存液體生產(chǎn)毒種批于-60℃保存不超過6個(gè)月可用于生產(chǎn)；凍干生產(chǎn)毒種批于-20℃以下保存2年內(nèi)可用于生產(chǎn)。2疫苗制造2.1細(xì)胞制備2.1.1地鼠選用10～14日齡健康地鼠，解剖取腎。如發(fā)現(xiàn)腎臟異?；蛴腥槊訝罡顾瑧?yīng)廢棄。2.1.2疫苗生產(chǎn)過程中不得使用青毒素或其他β內(nèi)酰胺類抗生素。2.1.3細(xì)胞消化及培養(yǎng)解剖取出腎臟后剪成碎塊，用適量的胰蛋白酶液消化，將分散后的細(xì)胞懸液種入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入生長液，置36～37℃培養(yǎng)。細(xì)胞生長成致密單層即可接種病毒。2.1.4外源因子檢查每批細(xì)胞留取5%～10%不接種病毒，加入與生產(chǎn)相同維持液后置33～35℃培育14天。在培育7、14天時(shí)分別做血吸附試驗(yàn)（方法同1.3.8項(xiàng)）。在觀察期內(nèi)細(xì)胞無病變并血吸附試驗(yàn)陰性為合格。如細(xì)胞出現(xiàn)病變或血吸附試驗(yàn)陽性，由該批細(xì)胞制備的病毒原液應(yīng)廢棄。2.2病毒接種和培育挑選長成致密單層的細(xì)胞，用洗液充分洗滌后加適量維持液，病毒接種量為2.7～3.7LogPFU/1.0ml，置35～36℃培育。2.3原液2.3.1收獲病毒液種毒后培育72小時(shí)以上，細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)收獲病毒液，澄清過濾后為原液。2.3.2原液檢定2.3.2.1無菌試驗(yàn)每瓶原液分別取樣做無菌試驗(yàn)，樣品種入硫乙醇酸鹽、乙良馬丁和肝斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)8天判定結(jié)果。2.3.2.2支原體檢查按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。2.3.2.3純毒試驗(yàn)每一消化批應(yīng)抽樣進(jìn)行純毒試驗(yàn)。方法同1.3.4項(xiàng)。2.3.2.4病毒滴定方法同1.3.3項(xiàng)。滴度≥7.2LogPFU/1.0ml為合格。2.4疫苗半成品2.4.1疫苗混合檢定合格的原液合并后，加適宜保護(hù)劑。每批疫苗量應(yīng)不超過15萬ml。2.4.2無菌試驗(yàn)按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行2.4.3分裝和凍干疫苗應(yīng)在冰浴下進(jìn)行分裝，采用適宜的凍干條件進(jìn)行凍干。出柜后應(yīng)在15℃以下進(jìn)行封口。3成品檢定3.1外觀檢查凍干疫苗應(yīng)為淡黃色疏松體。如稀釋液后迅速溶解，溶解后應(yīng)為HYPERLINK\o"中藥材：橘紅"橘紅色透明液體，無異物。3.2殘余水分含量凍干疫苗殘余水分應(yīng)≤3.5%。3.3pH值凍干疫苗用蒸餾水復(fù)溶后，pH值應(yīng)為7.2～8.0。3.4病毒滴定方法同1.3.3項(xiàng)。病毒滴度≥5.7LogPFU/1.0ml為合格。3.5熱穩(wěn)定性試驗(yàn)凍干疫苗置37℃7天后進(jìn)行滴定（方法同1.3.3項(xiàng)），滴度下降不應(yīng)超過1.0LogPFU/ml。3.6無菌試驗(yàn)按《生物制品無菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。3.7安全試驗(yàn)3.7.1腦內(nèi)致病力試驗(yàn)方法及判定標(biāo)準(zhǔn)同1.3.5項(xiàng)。3.7.2皮下感染入腦試驗(yàn)方法及判定標(biāo)準(zhǔn)同1.3.6項(xiàng)。3.7.3乳鼠傳代返祖試驗(yàn)。方法及判定標(biāo)準(zhǔn)同1.3.7項(xiàng)。3.8毒性試驗(yàn)凍干疫苗每支加稀釋液2.5ml溶解復(fù)原后，用體重12～15g小白鼠4只，每只腹腔注射0.5ml。注射后密切觀察，30分鐘內(nèi)不應(yīng)有異常反應(yīng)，觀察3天應(yīng)健存。3.9