中藥川芎有效成分鑒別的實驗材料

對于川芎的認(rèn)識一、補(bǔ)陽還五湯由黃芪，當(dāng)歸，赤芍，地龍，川芎，紅花，桃仁六味藥材組成。本次試驗主要研究黃芪，當(dāng)歸，川芎的有效成分。二、實驗分為兩部分：川芎中有效成分的提取與分離純化，以及運(yùn)用薄層色譜技術(shù)對中藥中有效成分的鑒別。三、川芎含揮發(fā)油約1％。鑒定出油中成分有40種，占揮發(fā)油的93.64％，其中主成分為藁本內(nèi)酯(ligustilide)占58%、3-丁酜內(nèi)酯(3-butylphthalide)5.29%和香檜烯(sabinene)6.08%。根莖中所含的內(nèi)酯化合物，除上述提到的二種外，尚含丁烯酜內(nèi)酯(butylidenephthalide)、川芎內(nèi)酯(sankyunolide)、新蛇床內(nèi)酯(neocnidilide)、4-羥基-3-丁酜內(nèi)酯(4-hydroxy-3-butylphthalide)、川芎酚(chuanxingol)、雙藁本內(nèi)酯(2,2'-diligustilide),以及3-丁基-3,6,7.三羥基-4,5,6,7-四氫苯酞等。含氮化合物有四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine,川芎嗪，chuanxiongzine)、perlolyrine、鹽酸三甲胺、鹽酸膽堿、L-異亮氨酰-L-纈氨酸酐(L-isobutyl-L-valineanhydride)、L-纈氨酰-L-纈氨酸酐、1-乙?；?卩-卡啉、尿嘧啶、腺嘌嶺和腺苷。酸性或酚性化合物有4-羥基-3-甲氧基苯乙烯、1-羥基-1-(3-甲氧基4-羥基苯)-乙烷、4-羥基苯甲酸、咖啡酸、香莢蘭酸、阿魏酸(ferulicacid)、瑟丹酸(sadanicacid)、大黃酸(chrysophicacid)、棕櫚酸、香莢蘭醛和亞油酸。此外,川芎根莖尚含中性油,其成分為十五、十六、十七、十八烷酸乙酯，異十七、異十八烷酸乙酯和異十七烷酸甲酯。另含5,5'-聯(lián)咲哺甲酰醚(bis-5,5'-formylfurfurylether)、匙葉桉油烯醇(spathulenol)、卩谷甾醇、蔗糖和一種脂肪酸甘油酯。含氮化合物中的川芎嗪是川芎根、莖中提取的一種活性生物堿——四甲基吡嗪,為川芎中最主要有效成分之一,約占生藥含量的0.1%?0.2%,川芎嗪主要有鹽酸川芎嗪(TMPH、和磷酸川芎嗪(TMPP、兩種形式。數(shù)種內(nèi)酯類化學(xué)成分，其中川芎內(nèi)酯A(4,5-二氫-3-丁烯基苯肽)B約占川芎生藥的1.6%,是川芎的主要成分。川芎的活性成分有以藁本內(nèi)酯、川芎內(nèi)酯為主的苯酞類,以川芎嗪為代表的含氮化合物類和以阿魏酸為代表的有機(jī)酸類。常用的中藥有效成分提取方法從藥材中提取活性成分的方法有溶劑法、水蒸氣蒸餾法及升華法等。一般用溶劑法提取中藥材的有效成分,常用的方法有浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法、連續(xù)回流提取法等。浸漬法：是在常溫或溫?zé)?60?80°C)條件下用適當(dāng)?shù)娜軇┙n藥材以溶出其中成分的方法。本法適用于有效成分遇熱不穩(wěn)定的或含大量淀粉、樹膠、果膠、黏液質(zhì)中藥的提取。滲漉法：是不斷向粉碎的中藥材中添加新鮮浸出溶劑,使其滲過藥材,從滲漉筒下端出口流出浸出液的一種方法。煎煮法：是在中藥材中加入水后加熱煮沸,將有效成分提取出來的方法。此法簡便,但含揮發(fā)性成分或有效成分遇熱易分解的中藥材不宜用此法?；亓魈崛》ǎ菏怯靡讚]發(fā)的有機(jī)溶劑加熱回流提取中藥成分的方法。但對熱不穩(wěn)定的成分不宜用此法。連續(xù)回流提取法：彌補(bǔ)了回流提取法中溶劑消耗量大，操作繁雜的不足，實驗室常用索氏提取器來完成本法操作。但此法時間較長。水蒸氣蒸餾法：適用于具有揮發(fā)性的，能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞，且難溶或不溶于水的成分的提取。升華法：固體物質(zhì)在受熱時不經(jīng)過熔融直接轉(zhuǎn)化為蒸氣，蒸氣遇冷后又凝結(jié)成固體的現(xiàn)象叫做升華。中藥中有一些成分具有升華的性質(zhì)，能利用升華法直接從中藥中提取出來。將提取法歸類，由溶劑提取法和非溶劑提取法。中藥有效成分的分離常用分離方法：溶劑法、沉淀法、結(jié)晶法、色譜分離法（一）溶劑法1.酸堿溶劑法：混合物中各組分的酸堿性不同進(jìn)行分離（1）酸溶：有機(jī)堿性成分可與無機(jī)酸成鹽而溶于水。（2）堿溶：具有羧基，用碳酸氫鈉；具有酚羥基，用氫氧化鈉；具有內(nèi)酯或內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的成分可被皂化而溶于水。使用注意：酸堿的強(qiáng)度、加熱溫度、與被分離成分接觸的時間等。溶劑分配法。原理：利用混合物中各成分在互不相溶的兩相溶劑中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離的方法。成分在兩相溶劑中分配系數(shù)相差越大，則分離效率越高。一般采用少量多次分配醫(yī).學(xué)教育網(wǎng)搜集整理提高萃取效率。需要注意的是防止乳化。1）系統(tǒng)溶劑萃取法：常用于中藥化學(xué)成分的初步分離漏斗2）連續(xù)液-液萃取裝置3）液滴逆流層析法（二）沉淀法原理：基于有些中藥化學(xué)成分能與某些試劑生成沉淀，或加入某些試劑后可降低某些成分在溶液中的溶解度而自溶液中析出的一種方法。專屬試劑沉淀法：例如：雷氏銨鹽沉淀季銨堿、膽甾醇沉淀甾體皂苷；明膠沉淀鞣質(zhì)。分級沉淀法：改變加入溶劑的極性或數(shù)量使沉淀逐步析出的方法。多糖、蛋白質(zhì)等。鹽析法：在混合物水溶液中加入易溶于水的無機(jī)鹽，最常用的是氯化鈉，至一定濃度或飽和狀態(tài)，使某些中藥成分在水中溶解度降低而析出，或用有機(jī)溶劑萃取出來。（三）結(jié)晶法1.原理：利用混合物中各成分在溶劑中的溶解度不同達(dá)到分離的方法，是純化物質(zhì)最后階段常采用的方法，其目的在于進(jìn)一步分離純化目標(biāo)化合物。2.溶劑選擇：被溶解成分的溶解度隨溫度不同應(yīng)有顯著差別；與被結(jié)晶的成分不應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)；沸點(diǎn)適中等。常用于結(jié)晶的溶劑有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸、吡啶等。當(dāng)用單一溶劑不能達(dá)到結(jié)晶時，可用兩種或兩種以上溶劑組成的混合溶劑進(jìn)行結(jié)晶操作。（四）色譜分離法1.吸附色譜原理：利用吸附劑對被分離化合物分子的吸附能力的差異，而實現(xiàn)分離的一類色譜。常用的吸附劑包括硅膠、氧化鋁、活性炭、聚酰胺等。（1）硅膠：吸附作用是由于顆粒表面有很多硅醇基，它可以和許多化合物形成氫鍵而具有一定的吸附作用，極性大小分離，廣泛，大多數(shù)成分的分離，微酸性、不宜分離堿性物質(zhì)。用硅膠加粘合劑處理方法如下：薄層類別吸附劑（g）：用水量（ml）活化硅膠G1:2或1:380°C或105°C1/2?1小時硅膠CMC-Na1:3（0.5%?1.0%CMC-Na水溶液）80°C20~30分鐘或陰干硅膠CMC-Na1:3（0.2%CMC-Na水溶液）80C20~30分鐘或陰干氧化鋁G1:2或1:2.5110C30分鐘氧化鋁-硅膠G（1:2）1:2.5或1:380C30分鐘硅膠-淀粉1:2105C30分鐘硅藻土G1:2110C30分鐘（2）氧化鋁：微堿性、適宜分離堿性物質(zhì)。（3）聚酰胺：適于分離黃酮、酚、醌類、有機(jī)酸及鞣質(zhì)。2.凝膠過濾色譜（排阻色譜、分子篩色譜）原理：主要是分子篩作用，根據(jù)凝膠的孔徑和被分離化合物分子的大小而達(dá)到分離目的。當(dāng)混合物溶液通過凝膠柱時，比凝膠孔隙小的分子可以自由進(jìn)入凝膠內(nèi)部，而比凝膠孔隙不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能通過凝膠顆粒間隙，首先被洗出。常用的是葡聚糖凝膠（sephadexG）和羥丙基葡聚糖凝膠（sephadexLH-20）。3.離子交換色譜原理：基于各成分解離度的不同而分離。離子交換劑的種類：離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠。應(yīng)用：主要用于生物堿、有機(jī)酸及氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖等水溶性成分的分離純化大孔樹脂色譜原理：大孔樹脂是一類沒有可解離基團(tuán)，具有多孔結(jié)構(gòu)，不溶于水的固體高分子物質(zhì)。它可以通過物理吸附有選擇地吸附有機(jī)物質(zhì)而達(dá)到分離的目的。色譜行為：反相的性質(zhì)，一般被分離物質(zhì)極性越大，越先被洗脫下來，極性越小，越后洗脫下來。對洗脫劑而言，極性大的溶劑洗脫能力弱，而極性小的溶劑則洗脫能力強(qiáng)，故大孔樹脂在水中的吸附性強(qiáng)。大孔吸附樹脂色譜被引進(jìn)應(yīng)用于中藥有效部位或有效成分的分離富集。它具有選擇性好、機(jī)械強(qiáng)度高、再生處理方便、吸附速度快等特點(diǎn)。分類：根據(jù)骨架材料是否帶功能基團(tuán)，大孔吸附樹脂可分為非極性、中等極性與極性三類。分配色譜（1） 基本原理利用物質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)不同而達(dá)到分離。（2） 分類正相色譜：固定相極性＞流動相極性，用于分離極性和中等極性的成分。常用固定相：氰基或氨基鍵合相；常用流動相為有機(jī)溶劑。反相色譜：固定相極性＜流動相極性，用于離非極性和中等極性的成分，常用C18或C8鍵合相。常用流動相為甲醇-水或乙腈-水。薄層色譜吸附薄層色譜法（1）吸附劑：常用的吸附劑有硅膠和氧化鋁，最常用的是氧化鋁。硅膠本身顯弱酸性，直接用于分離和檢識生物堿時，與堿性強(qiáng)的生物堿可形成鹽而使斑點(diǎn)的Rf值很小，或出現(xiàn)拖尾，或形成復(fù)斑，影響檢識效果。為了避免出現(xiàn)這種情況，在涂鋪硅膠薄層板時用稀堿溶液（0.1?0.5N的氫氧化鈉溶液）或緩沖液制成堿性硅膠薄板；或者使色譜過程在堿性條件下進(jìn)行，即在展開劑中加入少量堿性試劑，如二乙胺、稀氨溶液等；或在展開槽中放一盛有稀氨溶液的小杯，用中性展開劑在氨蒸氣中進(jìn)行展開。氧化鋁本身顯弱堿性，且吸附性能較力膠強(qiáng)，其不經(jīng)處理便可用于分離和檢識生物堿。（2）展開劑：展開劑系統(tǒng)多以親脂性溶劑為主，一般以氯仿為基本溶劑，根據(jù)色譜結(jié)果調(diào)整展開劑的極性。一般來說，硅膠和氧化鋁薄層色譜適用于分離和檢識脂溶性生物堿。尤其是氧化鋁的吸附力較硅膠強(qiáng)，更適合于分離親脂性較強(qiáng)的生物堿。分配薄層色譜：用于分離有些結(jié)構(gòu)十分相近的生物堿，可獲得滿意的效果。（1）支持劑與固定相：常用硅膠或纖維素粉作支持劑，以甲酰胺或水作固定相。（2）展開劑：分離脂溶性生物堿，以親脂性有機(jī)溶劑作展開劑；分離水溶性生物堿，則應(yīng)以親水性的溶劑作展開劑。在配制流動相時，需用固定相飽和。吸附劑：常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅硅膠硅膠吸附作用的強(qiáng)弱與硅醇基的含量多少有關(guān)。硅醇基能夠通過氫鍵的形成而吸附水分，因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。若吸水量超過17％，吸附力極弱不能用作為吸附劑，但可作為分配層析中的支持劑。對硅膠的活化，當(dāng)硅膠加熱至100?110°C時，硅膠表面因氫鍵所吸附的水分即能被除去。當(dāng)溫度升咼至500C時，硅膠表面的硅醇基也能脫水縮臺轉(zhuǎn)變?yōu)楣柩跬殒I，從而喪失了因氫鍵吸附水分的活往，就不再有吸附劑的性質(zhì)，雖用水處理亦不能恢復(fù)其吸附活性。所以硅膠的活化不宜在較咼溫度進(jìn)行（一般在170cC以上即有少量結(jié)合水失去）。硅膠是一種酸性吸附劑，適用于中性或酸性成分的層析。氧化鋁：氧化鋁可能帶有堿性（因其中可混有碳酸鈉等成分），對于分離一些堿性中草藥成分，如生物堿類的分離頗為理想。但是堿性氧化鋁不宜用于醛、酮、醋、內(nèi)酯等類型的化合物分離因離子交換反應(yīng)而吸附堿性化合物?；钚蕴恳话阈枰扔孟←}酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗凈，于80C干燥后即可供層析用。常用的顯色劑有些生物堿能和某些試劑反應(yīng)生成特殊的顏色，叫做顯色反應(yīng)，常用于鑒識某種生物堿。但顯色反應(yīng)受生物堿純度的影響很大，生物堿愈純，顏色愈明顯。常用的顯色劑有：（1）磯酸銨一濃硫酸溶液（Mandelin試劑）為1%磯酸銨的濃硫酸溶液。如遇阿托品顯紅色，可待因顯藍(lán)色，士的寧顯紫色到紅色。（2） 鉬酸銨一濃硫酸溶液（Frohde試劑）為1%鉬酸鈉或鉬酸銨的濃硫酸溶液，如遇烏頭堿顯黃棕色，小檗堿顯棕綠色，阿托品不顯色。（3） 甲醛一濃硫酸試劑（Marquis試劑）為30%甲醛溶液0.2ml與10ml濃硫酸的混合溶液。如遇嗎啡顯橙色至紫色，可待因顯紅色至黃棕色。4）濃硫酸如遇烏頭堿顯紫色、小檗堿顯綠色，阿托品不顯色。5）濃硝酸如遇小檗堿顯棕紅色，秋水仙堿顯藍(lán)色，咖啡堿不顯色。生物堿的顯色反應(yīng)原理尚不太明了，一般認(rèn)為是氧化反應(yīng)、脫水反應(yīng)、縮合反應(yīng)或氧化、脫水與縮合的共同反應(yīng)。薄層層析法具體操作注意事項鋪板鋪板用的勻漿不宜過稠或過?。哼^稠，板容易出現(xiàn)拖動或停頓造成的層紋；過稀，水蒸發(fā)后，板表面較粗糙。勻漿配比一般是硅膠G：水=1：2?3,硅膠G：羧甲基纖維素鈉水溶液=1：2.研磨勻漿的時間，根據(jù)經(jīng)驗來定，與空氣濕度有關(guān)，一般通過拿起研棒時勻漿下滴的情況來判斷，越稠越難下滴。勻漿的稀稠除影響板的平滑外，也影響板涂層的厚度，進(jìn)一步影響上樣量。涂層薄，點(diǎn)樣易過載；涂層厚，顯色不那么明顯。通常，板的質(zhì)量對薄層鑒別的影響不是很大，影響最大的是展開劑的配制和展開系統(tǒng)的飽和。點(diǎn)樣盡量用小的點(diǎn)樣管。如果有足夠的耐性，最好只用1微升的點(diǎn)樣管。這樣，點(diǎn)的斑點(diǎn)較小，展開的色譜圖分離度好，顏色分明。樣品溶液的含水量越小越好，樣品溶液含水量大，點(diǎn)樣斑點(diǎn)擴(kuò)散大。樣品溶液的溶劑一般是無水乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯。點(diǎn)好樣的薄層板用電吹風(fēng)的熱風(fēng)吹干或放入干燥器里晾干。點(diǎn)樣:體積宜在20ul以下，樣徑不超過2-3mm，點(diǎn)間距離為1.5-2.0cm,距底2.0cm.展開劑配制選擇合適的量器把各組成溶劑移入分液漏斗，強(qiáng)烈振搖使混合液充分混勻，放置，如果分層，取用體積大的一層作為展開劑。絕對不應(yīng)該把各組成溶液倒入展開缸，振搖展開缸來配制展開劑。混合不均勻和沒有分液的展開劑，會造成層析的完全失敗。各組成溶劑的比例準(zhǔn)確度對不同的分析任務(wù)有不同的要求，盡量達(dá)到實驗室儀器的最高精確度，比如：取1ml的溶劑，應(yīng)使用1ml的單標(biāo)移液管，移液管應(yīng)符合計量認(rèn)證要求，盡管多數(shù)時候這不是必須的。展開系統(tǒng)的飽和一般使用的是雙槽的展開缸，一槽用來放展開劑，另一槽可加入氨水或硫酸。把待展開的板放入兩槽間的平臺，斜架著，蓋上展開缸的蓋子。讓展開劑的蒸氣充滿展開缸，并使薄層板吸附蒸氣達(dá)到飽和，防止邊沿效應(yīng)，飽和時間在半個小時左右。展開時難免要打開蓋子把薄層板放入展開劑中，不過對薄層板與蒸氣的吸附平衡影響不大，當(dāng)然動作應(yīng)該盡量輕、快。［醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)搜集整理］溫濕度的控制溫濕度對薄層影響都很大。不凍結(jié)的前提下，通常溫度越低分離越好，較難的分離需在低溫下分離，例如人參皂苷。濕度的影響，估計主要是影響薄層板的吸附能力，導(dǎo)致選擇性（容量因子）的變化，濕度應(yīng)根據(jù)實際情況確定。溫度控制使用空調(diào)器或冰柜，濕度控制是通過在另一展開槽放置相應(yīng)濃度的硫酸。顯色噴顯色劑顯色最重要是有好的霧化器。顯色方法：直接噴霧法、浸漬法、壓板法1川芎總提物的提取分離本次實驗步驟提取川芎嗪取150g川芎飲片，稍粉碎．用95％乙醇于索氏回流提取裝置中回流提取9h。溶媒用量為8—10倍。提取液用布氏抽濾器抽濾．抽濾液減壓濃縮至干，再加適量水．加熱使溶解，抽濾，濾液加到已處理好的大孔樹脂柱（干膏和樹脂的比倒為1：15—20）上．控制加群流建為3秒／滴，慢慢滴加完后，先用水洗（1—2秒／滴）洗至還原糖反應(yīng)呈陰性，（1ml水洗脫液加人甲基萘酚0．5％試液2—3滴。沿試管壁緩緩加人0.5ml濃硫酸，陰性為二試液界面處出現(xiàn)棕色環(huán)）約用