PCR技術(shù)及腫瘤三項介紹

PCR技術(shù)及腫瘤三項介紹第1頁/共23頁PCR

PCR的基本原理變性,復(fù)性,半保留復(fù)制PCR三步曲變性90～97℃退火45～55℃延伸72℃左右聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：

是一種放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。第2頁/共23頁

循環(huán)次數(shù)DNA的鏈數(shù)

1

2122

2243

23810

210102420

220

1,048,57630

230

1,073,741,82410億

PCR循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)量關(guān)系PCR特點：高效擴增、忠實復(fù)制第3頁/共23頁實時熒光定量PCR

是一種在DNA擴增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。

實現(xiàn)了對DNA模板的定量而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強，能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染性、具實時性和準(zhǔn)確性等特點。第4頁/共23頁熒光定量PCR的臨床應(yīng)用感染性疾病的診斷母嬰傳播的控制與觀察遺傳疾病的診斷腫瘤的診斷法醫(yī)學(xué)鑒定個體化用藥指導(dǎo)第5頁/共23頁年齡老年，兒童，新生兒

性別體重/身高

合并癥病程器官功能肝臟,腎臟,心臟基因型

遺傳（占70%）環(huán)境因素食物

/吸煙/合并用藥藥物反應(yīng)第6頁/共23頁7預(yù)警遺傳相關(guān)疾病疾病相關(guān)遺傳缺損藥物基因組學(xué)關(guān)聯(lián)分析藥物相關(guān)遺傳缺損預(yù)防個體化治療HGP啟動了個體化醫(yī)學(xué)/基因組醫(yī)學(xué)治療方法開發(fā)基因治療藥物治療人基因數(shù)：~22,000潛在藥靶：~22,000現(xiàn)有藥靶：~500第7頁/共23頁8個體化藥物治療的目的避免藥物不良反應(yīng)最大化藥物效應(yīng)選擇有效個體第8頁/共23頁EGFR基因突變檢測KRAS基因突變檢測BRAF基因突變檢測二氫嘧啶脫氧酶（DPD）基因突變檢測UGT1A1基因多態(tài)性檢測PCR技術(shù)在腫瘤個性化治療中的應(yīng)用第9頁/共23頁

肺癌居于我國惡性腫瘤死亡率之首，每年新增60萬患者，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占85%。第10頁/共23頁EGFR表皮生長因子受體;是上皮生長因子細(xì)胞增值和信號傳導(dǎo)的受體；與腫瘤細(xì)胞的增殖，血管生成，腫瘤侵襲，轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡抑制有關(guān)。KRAS鼠類肉瘤病毒癌基因；是細(xì)胞信號內(nèi)傳導(dǎo)途徑中的一種信號傳導(dǎo)蛋白；像是體內(nèi)的一個開關(guān)，正常時可以抑制腫瘤細(xì)胞生長，一旦突變，就會刺激細(xì)胞生長，打亂規(guī)律，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。BRAF是一種癌基因，是EGFR通路中的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與調(diào)控細(xì)胞生長，分化和凋亡等多種生理過程。

腫瘤三項第11頁/共23頁12TKTK細(xì)胞存活(抗細(xì)胞凋亡)PI3-KSTAT3AKTPTENMEK基因轉(zhuǎn)錄MAPK細(xì)胞增殖/分化化療/放療抵抗血管增生腫瘤細(xì)胞遷移擴散pYpYRASRAFSOSGRB2pYG1SMG2非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中EGFR高表達(dá)；EGFR對腫瘤的增殖、分化、遷移等起重要作用抑制EGFR活性可阻斷下游的信號傳導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和血管增生，促進腫瘤細(xì)胞凋亡表皮生長因子受體（EGFR）

第12頁/共23頁用于檢測肺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤患者腫瘤組織EGFR（表皮生長因子受體）基因的突變情況。EGFR突變檢測可協(xié)助醫(yī)生選擇易瑞沙（Iressa，Gefitinib，吉非替尼)、特羅凱（Tarceva，它賽瓦；Erlotinib，厄洛替尼）等靶向藥物的有效人群。EGFR突變的患者建議使用該類藥物治療，無突變者不建議使用該類靶向藥物。第13頁/共23頁EGFR基因突變檢測是NSCLC靶向用藥的必檢項目第14頁/共23頁

K-ras基因是編碼一個GTP結(jié)合蛋白的癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物是EGFR信號傳導(dǎo)通路上的重要蛋白。K-ras基因突變一般會使結(jié)直腸癌和肺癌患者絡(luò)氨酸激酶抑制劑產(chǎn)生耐藥。第15頁/共23頁

判斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后以及了解腫瘤的治療效果：正常人血中檢出Kras基因異常，提示存在腫瘤易感性；良性腫瘤患者檢出Kras基因突變,提示有惡變的可能；Kras基因突變陽性，即使病理組織學(xué)診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性，癌癥復(fù)發(fā)的可能性也很高；《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)》(NCCN)腫瘤臨床指南及其中譯版均明確指出：只有K-ras野生型患者才建議接受靶向藥物的治療，突變型患者不建議進行分子靶向治療。檢測Kras基因突變可篩選用藥人群，實現(xiàn)腫瘤患者的個體化治療，延長患者生存期。第16頁/共23頁17增殖野生KRASEGFR西妥昔單抗細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外細(xì)胞膜野生型K-ras野生型的EGFR通路K-ras突變型的EGFR通路CTGGTGCCG增殖突變KRASEGFR西妥昔單抗細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外細(xì)胞膜突變型無效應(yīng)！KRAS突變?yōu)榛罨蛔?，使增殖不受上游信號控?2、13(96%)和61密碼子12號35G>A(甘天門冬）為主CTGATGCCGKras基因是RAS超家族中的原癌基因，其編碼蛋白的激活/失活受控于上游EGFR信號。單克隆抗體阻斷EGFR和Kras蛋白等下游信號傳導(dǎo)通路，抑制和逆轉(zhuǎn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。突變型Kras蛋白功能異常，無需EGFR活化信號刺激仍處于激活狀態(tài)，且不可控而始終處于激活狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤的持續(xù)增殖。對抗EGFR藥物治療無效。第17頁/共23頁BRAF介紹及應(yīng)用領(lǐng)域第18頁/共23頁黑色素瘤概況惡性黑色素瘤(黑色素瘤)是臨床上較為常見的皮膚粘膜和色素膜惡性腫瘤，也是發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一，年增長率為3％～5％。2010年全球黑色素瘤新發(fā)病例199627例，死亡例數(shù)為46372例［1］。雖然黑色素瘤在我國發(fā)病率較低，但近年來成倍增長，每年新發(fā)病例約2萬例［1］。［1］CSCO黑色素瘤專家委員會，中國黑色素瘤診治指南(2011版)，臨床腫瘤雜志2012年2月第17卷第2期第19頁/共23頁BRAF基因與黑色素瘤檢測我國468例原發(fā)黑色素瘤標(biāo)本，BRAF突變率為25,9％其中BRAFV600E是最常見的突變位點(87％)，這為中國患者使用BRAFV600E抑制劑(Vemurafenib)提供了理論基礎(chǔ)［1］。B-raf基因V600E突變導(dǎo)致抗EGFR抗體或EGFR酪氨酸激酶抑制劑類腫瘤靶向藥物的耐藥。部分沒有K-ras基因突變的患者也會對EGFR靶向藥物產(chǎn)生耐藥性，研究證明這主要是由于K-ras下游的B-raf基因V600E突變造成的［1］CSCO黑色素瘤專家委員會，中國黑色素瘤診治指南(2011版)臨床腫瘤雜志2012年2月第17卷第2期第20頁