基因工程基因文庫(kù)構(gòu)建

基因工程基因文庫(kù)構(gòu)建第1頁(yè)/共55頁(yè)2、基因文庫(kù)的分類基因組DNA：提取的染色體基因組DNA。如果要研究的是控制基因表達(dá)的調(diào)控序列，或是在mRNA中不存在的某種特定序列，有關(guān)這類的信息就只能從染色體基因組DNA中獲得。cDNA：mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA。如果研究的目標(biāo)是弄清一種蛋白質(zhì)的氨基酸順序，可以根據(jù)克隆的cDNA分子的核苷酸序列直接推導(dǎo)出來?；蚪M文庫(kù)（genomiclibrary）含有全部基因。cDNA文庫(kù)（cDNAlibrary）含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因。第2頁(yè)/共55頁(yè)用鳥槍法構(gòu)建基因組文庫(kù)，材料來自染色體DNA。用cDNA法構(gòu)建cDNA文庫(kù)，材料來自mRNA。在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時(shí)段的mRNA種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫(kù)一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫(kù)或胚胎組織cDNA文庫(kù)等。很顯然，cDNA文庫(kù)的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫(kù)。第3頁(yè)/共55頁(yè)(1)基因組文庫(kù)(Genomiclibrary)是指將某種生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機(jī)械力量切割成一定長(zhǎng)度范圍的DNA片段，再與合適的載體在體外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)的宿主細(xì)胞獲得的所有陽(yáng)性菌落，這個(gè)群體就稱為該生物基因組文庫(kù)。目的是分離有用的目的基因和保存某種生物的全部基因?；蚪M文庫(kù)根據(jù)DNA來源分為：核基因組文庫(kù)、葉綠體基因組文庫(kù)、線粒體基因組文庫(kù)?？寺⊥庠碊NA片段的切割主要采用機(jī)械斷裂或限制性部分酶解兩種方法，其基本原則：①DNA片段之間存在部分重疊序列。②DNA片段大小均一。第4頁(yè)/共55頁(yè)(2)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)：是指將某種生物體某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。cDNA(complementaryDNA，互補(bǔ)DNA)：是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的互補(bǔ)DNA?；蚪M文庫(kù)與cDNA文庫(kù)的最大區(qū)別：基因組文庫(kù)含有而cDNA文庫(kù)不含有非轉(zhuǎn)錄的基因組序列。2023/3/145第5頁(yè)/共55頁(yè)3、構(gòu)建基因文庫(kù)的基本方法將特定生物體的因組DNA或cDNA分解成適當(dāng)大小的DNA片段,然后分別與克隆載體連接成重組DNA分子。通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將帶有不同DNA片段的重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，獲得一套包含特定生物體所有DNA序列的克隆。第6頁(yè)/共55頁(yè)二、基因組文庫(kù)的構(gòu)建(一)基因組文庫(kù)的類型根據(jù)所選用的載體可以分為：質(zhì)粒文庫(kù)、噬菌體文庫(kù)、粘粒文庫(kù)、人工染色體文庫(kù)（細(xì)菌人工染色體文庫(kù)、酵母人工染色體文庫(kù)等）。第7頁(yè)/共55頁(yè)(二)基因文庫(kù)的完備性基因文庫(kù)的完備性是指：在構(gòu)建的基因文庫(kù)中任一基因存在的概率，它與基因文庫(kù)最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)第8頁(yè)/共55頁(yè)（三）基因組DNA文庫(kù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)除了盡可能高的完備性外，一個(gè)理想的基因組DNA文庫(kù)應(yīng)具備下列條件：重組克隆的總數(shù)不宜過大，以減輕篩選工作的壓力載體的裝載量最好大于基因的長(zhǎng)度，避免基因被分隔克隆?？寺∨c克隆之間必須存在足夠長(zhǎng)度的重疊區(qū)域，以利于克隆排序?？寺∑我子趶妮d體分子上完整卸下。重組克隆能穩(wěn)定保存、擴(kuò)增、篩選?！?頁(yè)/共55頁(yè)(四)基因組文庫(kù)構(gòu)建的一般步驟

①載體的選擇和制備。②高純度、大分子量基因組DNA的提取。③基因組DNA的部分酶切與分級(jí)分離。④載體與DNA片段的連接。⑤轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞。⑥篩選鑒定基因組及保存。

第10頁(yè)/共55頁(yè)①載體和受體的選擇出于壓縮重組克隆的數(shù)量，用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的載體通常選裝載量較大的l-DNA或考斯質(zhì)粒；對(duì)于大型基因組（如動(dòng)植物和人類）需使用YAC或BAC載體由于絕大多數(shù)真核生物的mRNA小于10kb，因此用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建的載體通常選質(zhì)?；騦-DNA上述幾種載體的最大裝載量如下：用于基因文庫(kù)構(gòu)建的受體則根據(jù)載體使用大腸桿菌或酵母菌第11頁(yè)/共55頁(yè)②基因組DNA的制備為了最大限度保證基因在克隆過程中的完整性，用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大（至少是插入片斷大小的3－5倍），文庫(kù)的重組率和完備性也就越高。用常規(guī)方法制備的染色體DNA的長(zhǎng)度一般在100kb左右如果先將細(xì)胞固定在低融點(diǎn)凝膠中，然后置入含有SDS蛋白酶K、RNaseA的緩沖液中浸泡，可獲得>100kb大小的DNA片段。AAAA第12頁(yè)/共55頁(yè)③基因組DNA的切割用于基因組文庫(kù)構(gòu)建的DNA片段的切割一般采用超聲波處理和限制性內(nèi)切酶部分酶切兩種方法，其目的是：①保證DNA片段之間存在部分重疊區(qū)。②保證DNA片段大小均一。超聲波處理后的DNA片段呈平頭末端，需加裝人工接頭。部分酶切法一般選用4堿基識(shí)別序列的限制性內(nèi)切酶，如：Sau3A或MboI等，這樣DNA酶解片段的大小可控連接前，上述處理的DNA片段必須根據(jù)載體的裝載量進(jìn)行分級(jí)分離，以杜絕不相干的DNA片段隨機(jī)連為一體?。?！第13頁(yè)/共55頁(yè)④載體與DNA片段的連接在基因組文庫(kù)的構(gòu)建過程中，大量體系連接前先使用小體系連接來尋找最佳比例！方法一：粘末端連接方法二：人工接頭法⑤轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞在基因組文庫(kù)的構(gòu)建過程中，最好選擇轉(zhuǎn)化效率高的。進(jìn)口感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)量穩(wěn)定的進(jìn)口包裝蛋白！第14頁(yè)/共55頁(yè)（五）基因組文庫(kù)構(gòu)建的技術(shù)性問題在基因組文庫(kù)的構(gòu)建過程中，最應(yīng)引起重視的問題是：嚴(yán)禁外源DNA片段之間的連接?。?！為了避免上述情況的發(fā)生，可采取下列措施的組合：將待連接的DNA片段根據(jù)載體的裝載量分級(jí)分離。用堿性磷酸單酯酶除去DNA片段的末端磷酸基團(tuán)。在DNA片段的末端添加人工接頭。第15頁(yè)/共55頁(yè)（六）構(gòu)建基因組文庫(kù)應(yīng)注意的問題構(gòu)建一個(gè)文庫(kù)，插入DNA和載體DNA的質(zhì)量是成功與否的關(guān)鍵?；蚪MDNA應(yīng)當(dāng)非常純以適應(yīng)DNA的酶解，而且基因組DNA也應(yīng)足夠大（最好超過200kb）以獲得兩個(gè)末端的消化產(chǎn)物。不論是載體DNA還是靶DNA不含外源片段是一個(gè)基本條件。污染少量探針順序或載體的基因組DNA將引起很大麻煩，這是因?yàn)樵诤Y選過程中它們將被鑒定為所要的克隆。第16頁(yè)/共55頁(yè)部分消化產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)是一組覆蓋整個(gè)基因組的隨機(jī)片段。識(shí)別4個(gè)堿基的限制酶要比識(shí)別6個(gè)堿基酶能產(chǎn)生更隨機(jī)的插入片段。部分消化所產(chǎn)生的片段應(yīng)能連接到設(shè)定的載體上。限制酶和部分消化過程應(yīng)事先檢查。一些批次的酶質(zhì)量不夠高而導(dǎo)致產(chǎn)生的DNA片段末端不能有效地連接。如果預(yù)期結(jié)果沒有出現(xiàn)，檢查限制酶和DNA濃度及純度。第17頁(yè)/共55頁(yè)在考慮把λ噬菌體臂和插入DNA片段連接過程中有兩個(gè)重要參數(shù)：λ噬菌臂和潛在插入片段的比例、基因組DNA的濃度和純度。大約10pgλ噬菌臂和4μgDNA能產(chǎn)生有效地包裝。對(duì)一個(gè)典型的基因組要產(chǎn)生一個(gè)可表達(dá)文庫(kù)，重組子數(shù)一般要大于1×106~6×l06。包裝抽提物的包裝效率貯存于液氮中可保持1年多。而在-70℃中只能保存幾星期，而且包裝效率還會(huì)降低。由于包裝抽提物的質(zhì)量是一個(gè)關(guān)鍵性因素，商業(yè)性包裝抽提物，例如Gigapack（Stratagene），都已有商售。這種包裝提取物質(zhì)量高，且在體外包裝λ噬菌體DNA和插入片段過程能產(chǎn)生大量的噬菌斑。第18頁(yè)/共55頁(yè)（七)原核生物基因組文庫(kù)的構(gòu)建1、原核生物基因組的提取染色體DNA質(zhì)粒DNA要求：制備的DNA的長(zhǎng)度為100-200kb。防止在制備過程中的機(jī)械斷裂。第19頁(yè)/共55頁(yè)2、酶切片段與載體連接⑴酶切片段及分離、純化基因組的不完全酶切①根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶

—四個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/256

—六個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率:1/1024②分離目的酶切片段大小的確定

—克隆單個(gè)基因：<10kb

—克隆基因族：<20kb③DNA不完全酶切條件的確定

—確定限制酶用量，改變酶切時(shí)間

—固定酶切時(shí)間，改變限制酶的用量第20頁(yè)/共55頁(yè)DNA的不完全酶切酶切片段回收低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段試劑盒回收目的片段第21頁(yè)/共55頁(yè)⑵酶切片段與克隆載體連接克隆載體的選擇：質(zhì)粒載體可承載15kbDNA左右片段載體可承載25kbDNA左右片段Cosmid載體可承載45kbDNA左右片段3、重組DNA轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞⑴根據(jù)克隆載體的性質(zhì)選擇合適的受體細(xì)胞常見的宿主細(xì)胞：DH5、HB101、JM101、JM109⑵重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞1）轉(zhuǎn)化法(transformation)2）轉(zhuǎn)染法(transfection)3）轉(zhuǎn)導(dǎo)法(transduction)第22頁(yè)/共55頁(yè)4、基因組DNA文庫(kù)克隆子保存與篩選⑴基因組DNA文庫(kù)的保存①文庫(kù)在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存方法：從瓊脂糖平板上挑取已長(zhǎng)出的克隆子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混合的細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-80℃儲(chǔ)存（加終濃度為25%的甘油）。缺點(diǎn)：因文庫(kù)菌落生長(zhǎng)的不均勻性而導(dǎo)致文庫(kù)中某些特定的序列過多或過少。第23頁(yè)/共55頁(yè)②保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個(gè)克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-80℃保存。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大。第24頁(yè)/共55頁(yè)⑵基因組文庫(kù)的篩選表型篩選法：表達(dá)性狀易于鑒別，如互補(bǔ)篩選?？剐院Y選法：如二氫葉酸還原酶可以使三甲芐。二氨嘧啶降解，而該化學(xué)物可抑制大腸桿菌生長(zhǎng)。分子雜交法：利用分子探針對(duì)文庫(kù)進(jìn)行篩選。免疫篩選法：利用多肽等作為抗原進(jìn)行原位雜交篩選。PCR篩選法：根據(jù)保守序列合成引物,擴(kuò)增特異性片段。第25頁(yè)/共55頁(yè)第26頁(yè)/共55頁(yè)從基因文庫(kù)中迅速準(zhǔn)確地鎖定目的基因至關(guān)重要，其成敗與所掌握的有關(guān)目的基因的背景知識(shí)密切相關(guān)。目的基因的背景知識(shí)包括：目的基因的部分或全部堿基序列已知。目的基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)或功能已知。目的基因與某些生物表型的相關(guān)性已知。第27頁(yè)/共55頁(yè)(八)用λ噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的步驟①準(zhǔn)備載體DNA(如置換型λ噬菌體載體)，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化并分離得到載體的左右兩臂。②純化真核細(xì)胞高分子質(zhì)量DNA，并用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶部分消化。③分離適當(dāng)大小的基因組DNA片段(20-24kb)。④連接載體與外源DNA。⑤連接產(chǎn)物體外包裝及感染。⑥基因組文庫(kù)的擴(kuò)增。第28頁(yè)/共55頁(yè)基因組文庫(kù)限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝第29頁(yè)/共55頁(yè)三、cDNA文庫(kù)構(gòu)建真核生物基因組大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含有大量的非編碼區(qū)、內(nèi)含子和重復(fù)序列等，直接利用基因文庫(kù)很難分離得到目的基因。即使分離到DNA片段，也要同cDNA序列進(jìn)行比較。mRNA是基因轉(zhuǎn)錄加工后的產(chǎn)物，且只在特定組織器官和發(fā)育時(shí)期表達(dá)。因此，從cDNA克隆文庫(kù)分離基因更具優(yōu)勢(shì)。此外，mRNA決定了功能蛋白質(zhì)的初始肽鏈的翻譯，可以用來研究蛋白質(zhì)的功能。第30頁(yè)/共55頁(yè)(一)cDNA文庫(kù)的特征從cDNA文庫(kù)獲得的是已經(jīng)過剪接、去除了內(nèi)含子的cDNA,它不含真核基因的間隔序列及調(diào)控區(qū),只反映mRNA的分子結(jié)構(gòu)，并不是真正意義上的基因。cDNA文庫(kù)僅包含某種組織或細(xì)胞正在表達(dá)的基因?；蚩偭可?，顯然比基因組DNA文庫(kù)小得多，很容易從中篩選克隆得到細(xì)胞特異表達(dá)基因。cDNA文庫(kù)是有時(shí)效性的，文庫(kù)構(gòu)建時(shí)的信息供體是某一時(shí)空條件下的細(xì)胞總mRNA，它是在轉(zhuǎn)錄水平上反映該生物在某一特定發(fā)育時(shí)期，某一特定組織(或器官)在某種環(huán)境條件下的基因表達(dá)情況并不能包括該生物有機(jī)體的全部基因，不同物種、不同組織的cDNA文庫(kù)不同。第31頁(yè)/共55頁(yè)(二)cDNA文庫(kù)的用途cDNA文庫(kù)可作為研究功能基因組學(xué)的基本手段。cDNA便于克隆和大量表達(dá),因此可以從cDNA文庫(kù)中篩選到所需的目的基因,并直接用于該目的基因的表達(dá)。cDNA文庫(kù)也可用于保護(hù)瀕危珍稀生物資源，提供構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜的所用探針，可用于分離全長(zhǎng)基因，進(jìn)而開展基因功能的研究。cDNA在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢(shì)，在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰老和死亡調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。第32頁(yè)/共55頁(yè)(三)cDNA文庫(kù)構(gòu)建的步驟細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離第一鏈cDNA合成第二鏈cDNA合成雙鏈cDNA的分級(jí)分離雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)?；蚴删w載體并導(dǎo)入宿主中繁殖重組體的篩選與鑒定第33頁(yè)/共55頁(yè)1、細(xì)胞總RNA的提取和mRNA的分離mRNA的來源:選用mRNA含量高的組織材料，或通過藥物等方法提高mRNA的含量。mRNA的制備:動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞mRNA的制備mRNA完整性的檢測(cè)哺乳動(dòng)物mRNA長(zhǎng)度為500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之間。第34頁(yè)/共55頁(yè)mRNA的提取全長(zhǎng)mRNA具有一個(gè)polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分離?？梢杂霉丫劾w維素柱，選擇性地吸附mRNA。第35頁(yè)/共55頁(yè)2、第一鏈cDNA的合成oligo(dT)引導(dǎo)的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷組成的oligo(dT)短片段，由反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈缺點(diǎn)：因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄酶無法到達(dá)mRNA分子的5’末端，必須從3’末端開始合成cDNA。對(duì)于大分子量的較長(zhǎng)的mRNA分子無法達(dá)到5’末端。第36頁(yè)/共55頁(yè)cDNA第一鏈的合成第37頁(yè)/共55頁(yè)隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成法：根據(jù)許多可能的序列，合成出6-10個(gè)核苷酸長(zhǎng)的寡核苷酸短片段（混合物），作為合成第一鏈cDNA的引物。在應(yīng)用這種混合引物的情況下，cDNA的合成可以從mRNA模板的許多位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生，而不僅僅從3’末端的oligo(dT)引物一處開始。比較容易合成特長(zhǎng)的mRNA分子的5‘端序列隨機(jī)引物cDNA合成的方法不適合構(gòu)建cDNA文庫(kù)，一般用于克隆特定mRNA的5'末端，如RT-PCR和5'-RACE。第38頁(yè)/共55頁(yè)3、第二鏈cDNA的合成cDNA第二鏈的合成就是將上一步形成的mRNA-cDNA雜合雙鏈變成互補(bǔ)雙鏈cDNA的過程。cDNA第二鏈的合成的方法大致4種：

自身引導(dǎo)合成法、置換合成法、引導(dǎo)合成法、引物－銜接頭合成法。第39頁(yè)/共55頁(yè)自身引導(dǎo)合成法：獲得的單鏈cDNA3’端會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以此作為第二鏈合成的引物，在Klenow酶或反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA的第二鏈。缺點(diǎn)：S1核酸酶切割cDNA的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致對(duì)應(yīng)于mRNA5’端的地方的序列出現(xiàn)缺失和重排。S1核酸酶的純度不夠時(shí)，會(huì)偶爾破壞合成的雙鏈cDNA分子。第40頁(yè)/共55頁(yè)自身合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失。第41頁(yè)/共55頁(yè)置換合成法：cDNA第一鏈合成反應(yīng)的產(chǎn)物cDNAmRNA不經(jīng)變性直接與RNA酶H和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ混合，此時(shí)RNA酶H在雜合雙鏈的mRNA鏈上產(chǎn)生缺口（內(nèi)切作用）并形成部分cDNA單鏈區(qū)（外切作用）DNA聚合酶Ⅰ則以殘存的mRNA作為引物合成cDNA第二鏈，最后用T4DNA連接酶修復(fù)缺口。用這種方法獲得的cDNA雙鏈分子含有殘留的一小段RNA，但這并不影響后續(xù)的克隆操作。優(yōu)點(diǎn)：cDNA雙鏈合成效率高，操作簡(jiǎn)捷無需對(duì)第一鏈合成產(chǎn)物進(jìn)行額外的變性處理，更重要的是避免了cDNA雙鏈分子末端的缺損。第42頁(yè)/共55頁(yè)置換合成法第43頁(yè)/共55頁(yè)引物合成法：在第一鏈合成完畢后，變性殘留的mRNA，用末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶在cDNA游離的3’羥基上添加同聚物（dC）末端，然后將之與人工合成的oligodG退火，形成引物結(jié)構(gòu)，在Klenow酶的作用下合成第二條cDNA鏈。第44頁(yè)/共55頁(yè)引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列第45頁(yè)/共55頁(yè)引物-銜接頭法第46頁(yè)/共55頁(yè)4、雙鏈cDNA的分級(jí)分離mRNA通過反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，在插入到克隆載體前，通過瓊脂糖凝膠電泳，將不同大小的cDNA分子分離開來。優(yōu)點(diǎn)：避免了分離過程中mRNA被污染的RNA酶降解增加了獲得全長(zhǎng)cDNA克隆的概率。獲得更準(zhǔn)確的分級(jí)分離效果（分子量）。第47頁(yè)/共55頁(yè)5、雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)粒或噬菌體載體并導(dǎo)入宿主中繁殖cDNA末端的處理由于大片段的平末端連接效率非常低，因此為了避免用平末端與載體連接，對(duì)雙鏈cDNA的末端進(jìn)行加工是十分必要的。方法：添加特異性核酸接頭以形成適合于克隆的黏性末端。末端轉(zhuǎn)移酶—可以向cDNA末端加上與克隆載體末端互補(bǔ)的尾部。第48頁(yè)/共55頁(yè)6、利用PCR技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫(kù)能夠從極其有限的起始材料中構(gòu)建cDNA文庫(kù)。以總RNA為模板合成cDNA，無需mRNA的純化，不僅簡(jiǎn)化操作，而且避免了低豐度信息分子的丟失。能夠提高cDNA文庫(kù)的完整性，獲得那些低水平表達(dá)的基因的cDNA克隆。此法對(duì)植物基因功能的研究，如對(duì)某種外界因素作用后或不同發(fā)育階段基因表達(dá)變化的研究尤為適用。第49頁(yè)/共55頁(yè)1、基因