實(shí)驗(yàn) 高效液相色譜法

1.掌握高效液相色譜法測(cè)定飲料中糖精鈉、苯甲酸和山梨酸的原理和方法

2.熟悉高效液相色譜儀的使用方法

3.了解高效液相色譜儀的儀器結(jié)構(gòu)[目的與要求]當(dāng)前1頁(yè)，總共31頁(yè)。[方法原理]

在適宜的條件下,高效液相色譜可同時(shí)分離飲料中的糖精鈉、苯甲酸、山梨酸。樣品超聲除去二氧化碳和乙醇,調(diào)pH至近中性,過(guò)濾后進(jìn)高效液相色譜儀,經(jīng)反相C18液相色譜分離后,紫外檢測(cè)器230nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。

以色譜峰的保留時(shí)間定性,利用色譜峰面積在一定范圍內(nèi)與濃度呈線性關(guān)系進(jìn)行定量當(dāng)前2頁(yè)，總共31頁(yè)。1.儀器:

高效液相色譜儀,配備二極管陣列檢測(cè)器;

超聲波清洗儀;50ml容量瓶;50ml燒杯;50μl微量進(jìn)樣器[儀器與試劑]當(dāng)前3頁(yè)，總共31頁(yè)。

糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(10.0mg/ml):

準(zhǔn)確稱(chēng)取于120℃烘干4h后的糖精鈉(C6H4CONNaSO2·2H2O)0.5000g,加水溶解后定容至50ml

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(5.0mg/ml):

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2500g,加碳酸氫鈉溶液25ml,加熱溶解,

定容至50ml

山梨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(5.0mg/ml):

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2500g山梨酸,加碳酸氫鈉溶液25ml,加熱溶解,定容至50ml

標(biāo)準(zhǔn)混合使用液

(含糖精鈉1.0mg/ml,苯甲酸0.5mg/ml,山梨酸0.5mg/ml):準(zhǔn)確吸取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液5.0ml,加水定容至50ml2.試劑:

稀氨水(1+1);碳酸氫鈉溶液:20g/L;甲醇(色譜純)當(dāng)前4頁(yè)，總共31頁(yè)。2.配制標(biāo)準(zhǔn)系列:

取9只50ml容量瓶分別編上號(hào)碼,按下表配制標(biāo)準(zhǔn)系列。當(dāng)前5頁(yè)，總共31頁(yè)。

混合標(biāo)樣中各物質(zhì)的濃度當(dāng)前6頁(yè)，總共31頁(yè)。當(dāng)前7頁(yè)，總共31頁(yè)。1.樣品處理:吸取10.00～20.00ml汽水,放入50ml燒杯中,超聲除去二氧化碳,用稀氨水調(diào)pH7.0,加水定容至50ml,用濾膜(0.45μm)過(guò)濾,備用。[操作步驟]當(dāng)前8頁(yè)，總共31頁(yè)。1.插好電極,打開(kāi)電源開(kāi)關(guān),按模式鍵切換到pH測(cè)量狀態(tài)2.用兩點(diǎn)法進(jìn)行校正(b=2)(pH4.01,6.86,9.18)3.按模式進(jìn)入b=24.將電極浸入標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中(pH=6.86),按“校正”,當(dāng)?shù)竭_(dá)終點(diǎn)時(shí)顯示屏上顯示相應(yīng)校正結(jié)果;將電極放入第二種標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(pH=4.01或9.18),按“校正”,當(dāng)?shù)竭_(dá)終點(diǎn)時(shí)顯示屏上顯示相應(yīng)校正結(jié)果;按“讀數(shù)”,保存校正結(jié)果并退回到正常的測(cè)量狀態(tài)5.將電極插入到被測(cè)液中,調(diào)節(jié)pH到所需值pH計(jì)的使用當(dāng)前9頁(yè)，總共31頁(yè)。(1)過(guò)濾：0.45um或更小孔徑濾膜

目的：除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無(wú)機(jī)鹽配制的緩沖液。前處理濾膜類(lèi)型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽醋酸纖維濾膜：不適用于有機(jī)溶劑，特別適用于水溶劑尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可以用于強(qiáng)酸，不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：同樣適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑當(dāng)前10頁(yè)，總共31頁(yè)。3.測(cè)定色譜條件:

色譜柱:C18,4.6mm×150mm;流動(dòng)相:

甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液(5+95);流速:1ml/min檢測(cè)波長(zhǎng):230nm

取樣品處理液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各10μl注入高效液相色譜儀進(jìn)行分離,以其標(biāo)準(zhǔn)溶液峰的保留時(shí)間為依據(jù)進(jìn)行定性。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(或計(jì)算回歸方程),從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出(或根據(jù)回歸方程求出)樣液中被測(cè)物質(zhì)的含量,按下式計(jì)算:當(dāng)前11頁(yè)，總共31頁(yè)。式中:Cx為樣品中被測(cè)物的含量,g/kgC為在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的相對(duì)應(yīng)的糖精鈉、苯甲酸、山梨酸的含量,mg/mlV0為樣品定容體積,mlV為取樣體積,ml當(dāng)前12頁(yè)，總共31頁(yè)。[思考題]1.為什么被測(cè)溶液需要除去二氧化碳?2.采用230nm為測(cè)定波長(zhǎng),對(duì)樣品中山梨酸的測(cè)定有何影響？當(dāng)前13頁(yè)，總共31頁(yè)。[注意事項(xiàng)]1.流動(dòng)相使用前必須經(jīng)過(guò)脫氣。如果流動(dòng)相中含有氣體,在較高的柱壓下會(huì)產(chǎn)生氣泡,使流動(dòng)相流動(dòng)受阻,對(duì)分離樣品產(chǎn)生不利影響2.應(yīng)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整和最后確定流動(dòng)相實(shí)際配比,以使各分析組分的分離效果最佳3.被測(cè)溶液pH值對(duì)測(cè)定和色譜柱使用壽命均有影響,以中性為宜4.苯甲酸、糖精鈉的靈敏波長(zhǎng)為230nm,山梨酸靈敏波長(zhǎng)為254nm,在此波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)苯甲酸和糖精鈉的靈敏度較低,因此采用230nm為測(cè)定波長(zhǎng)當(dāng)前14頁(yè)，總共31頁(yè)。(2)脫氣：

除去流動(dòng)相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡

氣泡對(duì)測(cè)定的影響：

1）泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積

2）柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形

3）檢測(cè)器中的氣泡產(chǎn)生基線波動(dòng)A.示差折射率檢測(cè)器*使折射率變化B.UV檢測(cè)器（200nm以下）*溶解氧氣有吸收C.熒光檢測(cè)器*溶解氧氣有消光作用當(dāng)前15頁(yè)，總共31頁(yè)。1.吸氣器法（流動(dòng)相抽濾）

*可以抑制制做流動(dòng)相時(shí)產(chǎn)生的氣泡

*只是暫時(shí)的脫氣法

*不能解決因溶解氣體造成的問(wèn)題2.超聲脫氣法3.使用氟樹(shù)脂膜的減壓脫氣法溶劑前處理-脫氣當(dāng)前16頁(yè)，總共31頁(yè)?！锸褂贸暡ㄕ鹗幤?，一般超聲震蕩15分鐘左右★注意流動(dòng)相在超聲震蕩脫氣過(guò)程中，溫度會(huì)升高，應(yīng)待其降至室溫后再上機(jī)使用?！镉捎谝后w對(duì)氣體的溶解作用，時(shí)間長(zhǎng)后氣體會(huì)再溶入流動(dòng)相中，應(yīng)引起注意。溶劑前處理-脫氣當(dāng)前17頁(yè)，總共31頁(yè)。溶劑前處理-脫氣使用氟樹(shù)脂膜的減壓脫氣法氟樹(shù)脂膜真空室真空泵流動(dòng)相往送液泵當(dāng)前18頁(yè)，總共31頁(yè)。緩沖液的使用使用前必須過(guò)濾使用后一定要進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞:

用含5%甲醇的水溶液沖洗30min（1ml/min），再用甲醇沖洗30min用純水沖洗泵頭清洗管路易受到細(xì)菌和霉菌的影響不能直接用有機(jī)溶劑沖洗緩沖鹽溶液緩沖液當(dāng)前19頁(yè)，總共31頁(yè)。當(dāng)前20頁(yè)，總共31頁(yè)。流動(dòng)相的更換不互溶的流動(dòng)相不能直接更換緩沖鹽不能直接用有機(jī)溶劑更換水正己烷異丙醇緩沖鹽有機(jī)溶劑水當(dāng)前21頁(yè)，總共31頁(yè)。液相色譜簡(jiǎn)易流程圖輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器溶劑數(shù)據(jù)處理廢液當(dāng)前22頁(yè)，總共31頁(yè)。液相系統(tǒng)維護(hù)流程圖吸濾頭單向閥柱塞密封圈線路過(guò)濾器手動(dòng)進(jìn)樣器檢測(cè)器色譜柱當(dāng)前23頁(yè)，總共31頁(yè)。泵工作示意圖

凸輪柱塞桿柱塞密封圈單向閥

泵頭流動(dòng)相入口流動(dòng)相出口當(dāng)前24頁(yè)，總共31頁(yè)。LC-20AT串聯(lián)式柱塞往復(fù)泵LC-20AD并聯(lián)式微體積柱塞往復(fù)泵柱塞泵的基本結(jié)構(gòu)LC-10ATvp

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單向閥單向閥單向閥1_at.flv1_ad.flv當(dāng)前25頁(yè)，總共31頁(yè)。單向閥單向閥結(jié)構(gòu)球座吸液沖程排液沖程出口單向閥進(jìn)口單向閥泵頭拋光面寶石球流動(dòng)相單向閥工作原理當(dāng)前26頁(yè)，總共31頁(yè)。單向閥結(jié)構(gòu)請(qǐng)不要分解閥心A和閥心B重新組裝后性能不被保證，輸液可能不穩(wěn)定注意：當(dāng)前27頁(yè)，總共31頁(yè)。線路過(guò)濾器故障：堵塞現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力偏高措施：異丙醇