第二章基因工程工具酶

DNA重組技術(shù)的基本工具“分子手術(shù)刀”“分子運(yùn)輸車”“分子縫合針”基因工程的工具酶

限制性內(nèi)切酶I型限制性內(nèi)切酶II型限制性內(nèi)切酶III型限制性內(nèi)切酶

DNA連接酶E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶

載體克隆載體表達(dá)載體當(dāng)前1頁(yè)，總共71頁(yè)。一、基因工程的工具酶1、工具酶的概念與種類工具酶：凡是基因工程中應(yīng)用的酶類通稱為基因工程工具酶。修飾切連按用途為三類限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶DNA修飾酶當(dāng)前2頁(yè)，總共71頁(yè)。2、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionenzyme)

（1）限制性核酸內(nèi)切酶的概念核酸酶：切割相鄰的兩個(gè)核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，導(dǎo)致核酸分子多核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的酶叫做核酸酶。

限制性核酸內(nèi)切酶：一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異的核苷酸序列（4~8bp），并由此處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。當(dāng)前3頁(yè)，總共71頁(yè)。（2）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)"forthediscoveryofrestrictionenzymesandtheirapplicationtoproblemsofmoleculargenetics"TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1978WernerArberSwitzerland1929~DanielNathansUSA1928~1999HamiltonO.SmithUSA1931~當(dāng)前4頁(yè)，總共71頁(yè)。20世紀(jì)60年代在研究細(xì)菌的限制和修飾現(xiàn)象時(shí)被Linn和Arber發(fā)現(xiàn)。寄主限制與修飾現(xiàn)象(Restrictionandmodification)在E.coli

K上生長(zhǎng)的λ噬體則表示為λ（K）。實(shí)驗(yàn)表明，用這種λ（K）噬菌體感染E.coli

B，形成噬菌斑的效率就很低因此λ（K）噬菌體受到了B菌體的限制。11當(dāng)前5頁(yè)，總共71頁(yè)。限制性內(nèi)切酶將侵入細(xì)菌體內(nèi)的外源DNA切成小片段。限制（Restriction）當(dāng)前6頁(yè)，總共71頁(yè)。細(xì)菌自身的DNA堿基被甲基化酶甲基化修飾所保護(hù)，不能被自身的限制性內(nèi)切酶識(shí)別切割。修飾（Modification）①Dam甲基化酶GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二個(gè)C上C5位置上引入甲基當(dāng)前7頁(yè)，總共71頁(yè)。生物體內(nèi)普遍存在的限制修飾現(xiàn)象。限制是restriction,修飾modification,所以把這一系統(tǒng)叫做：R/M體系。限制與修飾是由兩種酶引起的，一種是甲基轉(zhuǎn)移酶，一種是核酸內(nèi)切酶。限制與修飾存在兩方面的作用：一是保護(hù)自身的DNA不受限制，即不被切割；二是破壞外源DNA使之迅速降解。當(dāng)前8頁(yè)，總共71頁(yè)。（3）限制性核酸內(nèi)切酶的種類當(dāng)前9頁(yè)，總共71頁(yè)。（4）限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名Haemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株HindIII同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶EcoRIEscherichia屬名Coli種名Ry13株系編號(hào)若種名頭2個(gè)字母相同則其中一個(gè)可用種名的第一和第三個(gè)字母。當(dāng)前10頁(yè)，總共71頁(yè)。（5）限制性核酸內(nèi)切酶的特征特異的識(shí)別序列、嚴(yán)格切割位點(diǎn)EcoRI的切割位點(diǎn)EcoRI的識(shí)別序列5′…GCTGAATTCGAG…3′3′…CGACTTAAGCTC…5′Cleavagesites識(shí)別４-8個(gè)相連的核苷酸

4個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：Sau3AⅠ↓GATC

5個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：EcoRⅡ↓CCWGG

NciⅠCC↓SGG6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：EcoRⅠG↓AATTC識(shí)別序列與DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)識(shí)別序列越長(zhǎng)切割頻率越小識(shí)別序列越短切割頻率越大當(dāng)前11頁(yè)，總共71頁(yè)。識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)EcoRI5′…GCTGAATTCGAG…3′3′…CGACTTAAGCTC…5′5’G↓G-A-T-C-C3’3’C-C-T-A-G↑G5’BamHI居然天上客客上天然居切點(diǎn)大多數(shù)在識(shí)別序列之內(nèi)，也有的在序列兩側(cè)Sau3AⅠ5′…

↓GATC…3′EcoRⅡ5′…

↓CCWGG…3′

NciⅠ5′…

CC↓SGG…3′

EcoRⅠ5′…

G↓AATTC…3′

當(dāng)前12頁(yè)，總共71頁(yè)。切點(diǎn)大多數(shù)在識(shí)別序列之內(nèi)，也有的在序列兩側(cè)Sau3AⅠ5′…

↓GATC…3′EcoRⅡ5′…

↓CCWGG…3′

NciⅠ5′…

CC↓SGG…3′

EcoRⅠ5′…

G↓AATTC…3′

限制酶切后產(chǎn)生兩個(gè)末端末端結(jié)構(gòu)：５’-Ｐ和３’-ＯＨ末端種類：平頭末端和黏性末端３’-端突起和５’-端突起當(dāng)前13頁(yè)，總共71頁(yè)。PstI等產(chǎn)生的3′粘性末端5′…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3′3′…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5′PstI37℃5′…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3′3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’當(dāng)前14頁(yè)，總共71頁(yè)。３’-端突起

PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’５’-端突起

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAG-5’平頭末端（Bluntends）

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’當(dāng)前15頁(yè)，總共71頁(yè)。粘性末端的意義ii）同一個(gè)DNA分子內(nèi)連接：通過(guò)兩個(gè)相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。i）不同的DNA雙鏈：只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。這比連接兩個(gè)平齊末端容易的多。①連接便利②粘性末端標(biāo)記凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶進(jìn)行32P標(biāo)記。凸出的3’端可以通過(guò)末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個(gè)多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。③補(bǔ)平成平齊末端粘性末端可以用DNA聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。當(dāng)前16頁(yè)，總共71頁(yè)。（6）同位酶、同尾酶與同裂酶同位酶：具有相同的識(shí)別序列，但是酶切位點(diǎn)不同。

SmaICCC↓GGGXmaIC↓CCGGG同尾酶：來(lái)源各異，識(shí)別序列不同，但切割后產(chǎn)生相同的黏性末端。SalIG↓

TCGACXhoIC↓TCGAG同裂酶：能識(shí)別相同序列，且識(shí)別位點(diǎn)與切割位點(diǎn)均相同，但來(lái)源不同的兩種或多種限制酶。SstICCGC↓GGSacICCGC↓GG當(dāng)前17頁(yè)，總共71頁(yè)。（7）大部分II型核酸內(nèi)切酶需要的反應(yīng)條件不同的酶使用不同的類型反應(yīng)體系Tris-HCl50mMpH7.4MgCl210mMDTT/BSA1mMVolume20-100μlTep.andTime37℃,1-1.5hr1U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1μg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量當(dāng)前18頁(yè)，總共71頁(yè)。（8）影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素

①DNA的純度蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等加大酶的用量，1mgDNA用10U酶加大反應(yīng)總體積延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間當(dāng)前19頁(yè)，總共71頁(yè)。②DNA樣品的甲基化程度大腸桿菌中的dam甲基化酶在5′GATC3′序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影響的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影響大腸桿菌中的dcm甲基化酶在5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影響的酶有EcoRII等哺乳動(dòng)物中的甲基化酶在5′CG3′序列中的C5位上引入甲基當(dāng)前20頁(yè)，總共71頁(yè)。③酶切消化反應(yīng)溫度不同酶之間所需最適反應(yīng)溫度不同，且彼此間有相當(dāng)大的變動(dòng)范圍。大多數(shù)酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是37℃。例外：SmaⅠ25℃ApaⅠ30℃MaeⅠ45℃TaqⅠ65℃當(dāng)前21頁(yè)，總共71頁(yè)。④DNA的分子結(jié)構(gòu)DNA分子的不同構(gòu)型對(duì)核酸內(nèi)切限制酶的活性也有很大的影響。某些核酸內(nèi)切限制酶切割超盤旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA的高出許多倍，最高的可達(dá)20倍。此外，還有一些核酸內(nèi)切限制酶，切割它們自己的處于不同部位的限制位點(diǎn)，其效率亦有明顯的差別。當(dāng)前22頁(yè)，總共71頁(yè)。⑤核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的組份包括：氯化鎂、氯化納或氯化鉀、Tris-HCl，?-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常發(fā)揮，是絕對(duì)地需要二價(jià)的陽(yáng)離子，通常是Mg2+。不正確的NaCl或Mg2+濃度，不僅會(huì)降低限制酶的活性，而且還可能導(dǎo)致識(shí)別序列特異性的改變。⑥酶切時(shí)間

通常酶切時(shí)間1－2小時(shí)，但大多數(shù)酶的活性可維持很長(zhǎng)時(shí)間，我們可以酶切過(guò)夜。當(dāng)前23頁(yè)，總共71頁(yè)。高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端pH值等，會(huì)使一些核酸內(nèi)切酶的識(shí)別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的星號(hào)活性（Staractivity）現(xiàn)象，即限制酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，能切割一些與之特異型識(shí)別順序類似的序列，降低酶切的特異性，這種現(xiàn)象稱為星號(hào)活性。⑦非適宜環(huán)境EcoRI在正常條件下識(shí)別并切割5′GAATTC3′序列，但在甘油濃度超過(guò)5%（v/v）時(shí)，也可切割5′PuPuATPyPy3′或者5′AATT3′當(dāng)前24頁(yè)，總共71頁(yè)。抑制星號(hào)活性的方法

1)盡量用較少的酶進(jìn)行完全消化反應(yīng)。這樣可以避免過(guò)度消化以及過(guò)高的甘油濃度。2)盡量避免有機(jī)溶劑（如制備DNA時(shí)引入的乙醇）的污染。3)將離子濃度提高到100-150mM（若酶活性不受離子強(qiáng)度影響）。4)將反應(yīng)緩沖液的pH值降到7.0。5)二價(jià)離子用Mg2+。當(dāng)前25頁(yè)，總共71頁(yè)。不同的酶生產(chǎn)廠家適合各種不同反應(yīng)的緩沖液TakaraNEBLTI(Gibcol-BRL)PromegaRocheMBI當(dāng)前26頁(yè)，總共71頁(yè)。3、DNA連接酶（ligase）（1）DNA連接酶的概念是指利用ATP分子中的-磷酸基團(tuán)為能量，通過(guò)催化兩條并排DNA鏈的5-磷酸基團(tuán)和3-羥基之間，形成一個(gè)磷酸二酯鍵，而使兩個(gè)DNA片段共價(jià)連接起來(lái)的特異的核酸酶。ATP依賴的DNA連接酶NAD＋依賴的DNA連接酶大多數(shù)原核生物DNA連接酶真核生物和病毒DNA連接酶，如T4DNA連接酶、真核生物DNA連接酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類型當(dāng)前27頁(yè)，總共71頁(yè)。（2）DNA連接酶的特性DNA連接酶不能連接兩條單鏈DNA分子或環(huán)化的單鏈DNA分子，被連接的必須是雙螺旋DNA的一部分。當(dāng)前28頁(yè)，總共71頁(yè)。DNA連接酶只能連接DNA雙螺旋骨架上的切口，而不能連接缺口。當(dāng)前29頁(yè)，總共71頁(yè)。T4DNA連接酶用途：1）互補(bǔ)粘性末端的連接;2）平頭末端的相連；3）一條帶有切口的雙鏈DNA分子；4）

DNA雜合體中ＲＮＡ鏈上的切口。E.coliDNA連接酶用途：1)互補(bǔ)粘性末端的連接;2)一條帶有切口的雙鏈DNA分子。當(dāng)前30頁(yè)，總共71頁(yè)。（1）由ATP（或NAD+）提供AMP，形成酶-AMP復(fù)合物，同時(shí)釋放出PPi或NMN；（3）連接機(jī)理（2）激活的AMP結(jié)合在DNA鏈5’端的磷酸基團(tuán)上，產(chǎn)生含高能磷酸鍵的焦磷酸酯鍵；（3）與相鄰DNA鏈3’羥基相連，形成磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。當(dāng)前31頁(yè)，總共71頁(yè)。（4）不同末端連接策略①單酶切產(chǎn)生的相同黏性末端當(dāng)前32頁(yè)，總共71頁(yè)。②雙酶切產(chǎn)生的黏性末端當(dāng)前33頁(yè)，總共71頁(yè)。③雙酶切產(chǎn)生不同的5突出末端當(dāng)前34頁(yè)，總共71頁(yè)。④雙酶切產(chǎn)生不同的3突出末端當(dāng)前35頁(yè)，總共71頁(yè)。⑤雙酶切產(chǎn)生的5突出末端和3突出末端當(dāng)前36頁(yè)，總共71頁(yè)。⑥平切產(chǎn)生的平末端當(dāng)前37頁(yè)，總共71頁(yè)。平末端DNA片段的連接操作從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多提高平末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價(jià)陽(yáng)離子（NaCl），最終濃度150-200mM當(dāng)前38頁(yè)，總共71頁(yè)。常用的平末端DNA片段連接法，主要有同聚物加尾法、銜接物連接法及接頭連接法

同聚物加尾法當(dāng)前39頁(yè)，總共71頁(yè)。銜接物連接法銜接物（linker），是指用化學(xué)方法合成的一段由10～12個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。當(dāng)前40頁(yè)，總共71頁(yè)。DNA接頭，是一類人工合成的一頭具某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當(dāng)前41頁(yè)，總共71頁(yè)。Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20μlTep.andTime4-15℃,4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時(shí)，完全連接1μgλDNA（HindIII片段）所需的酶量（5）DNA連接酶的反應(yīng)條件當(dāng)前42頁(yè)，總共71頁(yè)。增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。插入片段與載體的濃度比例

反應(yīng)溫度插入片段濃度高，至少2︰1。一般14~16℃（6）影響DNA連接反應(yīng)的因素平末端DNA分子的連接最適反應(yīng)的酶量為1~2個(gè)單位，粘末端的連接，酶量為0.1個(gè)單位較好。DNA連接酶用法與用量當(dāng)前43頁(yè)，總共71頁(yè)。4、DNA聚合酶（ligase）（1）DNA聚合酶的概念和類型DNA聚合酶：指在DNA(或RNA)模板指導(dǎo)下，以4種脫氧核糖核苷酸（dNTP）為底物，在引物3’-OH末端聚合DNA鏈的一類酶。DNA聚合酶的類型根據(jù)DNA聚合酶所使用的模板不同，將其分為兩類：（1）依賴于DNA的DNA聚合酶；（2）依賴于RNA的DNA聚合酶。當(dāng)前44頁(yè)，總共71頁(yè)。大腸桿菌DNA聚合酶Klenowfragment(克列諾酶)T7DNA聚合酶T4DNA聚合酶修飾過(guò)的T7DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶（2）常見(jiàn)DNA聚合酶及共有特點(diǎn)當(dāng)前45頁(yè)，總共71頁(yè)。以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成DNA;需要模板和引物的存在;不能起始合成新的DNA鏈;催化dNTP加到生長(zhǎng)中的DNA鏈的3'-OH末端;催化DNA合成的方向是5'→3'。共同特點(diǎn)主要區(qū)別持續(xù)合成能力和外切酶活性不同。T7DNA聚合酶可以連續(xù)添加數(shù)千個(gè)dNTPs而不從模板上掉下來(lái)。其它幾種DNA聚合酶只能連續(xù)添加10多個(gè)dNTPs就會(huì)從模板上解離下來(lái)。當(dāng)前46頁(yè)，總共71頁(yè)。DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無(wú)中低T4DNA聚合酶高無(wú)中低T7DNA聚合酶高無(wú)快高化學(xué)修飾T7DNA聚合酶低無(wú)快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無(wú)無(wú)快高逆轉(zhuǎn)錄酶無(wú)無(wú)低中TaqDNA聚合酶無(wú)有快高常用DNA聚合酶的特性比較當(dāng)前47頁(yè)，總共71頁(yè)。（3）DNA聚合酶I大腸桿菌的DNA聚合酶I是一條約1000個(gè)aa的多肽鏈形成的單亞基蛋白，分子量109Da.三種活性：

聚合酶活性：將4種脫氧核糖核苷酸聚合為新的DNA鏈。

5’3’外切酶活性:

位于N端

3’

5’外切酶活性:防止錯(cuò)配。當(dāng)前48頁(yè)，總共71頁(yè)。①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③帶有3’—OH游離端的引物④DNA模板DNA聚合酶I（PolI）的聚合活性反應(yīng)條件-OH5’

3’

dNTPs當(dāng)前49頁(yè)，總共71頁(yè)。標(biāo)記①核酸探針（probe）能夠同某種被研究的核酸序列特異性結(jié)合的，帶有標(biāo)記的寡聚核酸分子。用DNA聚合酶I制備探針已知序列的核酸片段顯示位置與互補(bǔ)的待測(cè)序列雜交當(dāng)前50頁(yè)，總共71頁(yè)。標(biāo)記已知序列的核酸片段②探針的標(biāo)記方式標(biāo)記已知序列的核酸片段5’

3’

標(biāo)記一端帶有放射性的已知序列的核酸片段全序列標(biāo)記當(dāng)前51頁(yè)，總共71頁(yè)。③DNA聚合酶I對(duì)探針序列的標(biāo)記切口轉(zhuǎn)移法(nicktranslation)：放射性同位素標(biāo)記：DNA聚合酶I同時(shí)具備5’3’外切酶活性和5’3’的聚合酶活性（以及3’5’外切酶活性）。當(dāng)前52頁(yè)，總共71頁(yè)。5’3’外切酶活性從DNA切口的下一段DNA5’端除去一個(gè)核苷酸后，聚合酶活性就會(huì)在切口的上一段DNA的3’一側(cè)補(bǔ)上一個(gè)新的核苷酸。切口切口5’

5’

3’

3’

5’

3’

5’

3’

當(dāng)前53頁(yè)，總共71頁(yè)。純化的DNA片段DNaseI制造單鏈切口DNAPolI進(jìn)行切口轉(zhuǎn)移一種-32P-dNTP和dNTPs5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

3’

32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾都被標(biāo)記當(dāng)前54頁(yè)，總共71頁(yè)。（4）Klenowfragment用枯草桿菌蛋白酶處理PolI可以切掉N端的5’3’外切酶活性部分。就成為Klenowfragment。323個(gè)氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段605個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ當(dāng)前55頁(yè)，總共71頁(yè)。②DNA3’末端標(biāo)記在3’隱蔽端加上放射性標(biāo)記的dNTP。①3’端補(bǔ)平5’

5’

klenow補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的3’隱蔽端。klenow主要用途當(dāng)前56頁(yè)，總共71頁(yè)。3’隱蔽末端的DNA片段Klenowfragment補(bǔ)平根據(jù)末端的順序選擇一種-32P-dNTPs末端標(biāo)記的DNA限制性內(nèi)切酶切5’----G3’

3’----CTTAA5’

5’----GAA3’

3’----CTTAA5’

5’----GAATT3’

3’----CTTAA5’

5’----G3’

3’----CCTAG5’

5’----GG3’

3’----CCTAG5’

5’----GGATC3’

3’----CCTAG5’

EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h當(dāng)前57頁(yè)，總共71頁(yè)。③cDNA第二鏈的合成mRNAcDNA第一鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物當(dāng)前58頁(yè)，總共71頁(yè)。（5）逆轉(zhuǎn)錄酶依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）。a、鳥(niǎo)類骨髓母細(xì)胞瘤病毒(AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶b、莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶主要種類5’3’聚合酶活性5’3’外切酶活性3’5’外切酶活性RNaseH活性末端轉(zhuǎn)移酶活性酶活性當(dāng)前59頁(yè)，總共71頁(yè)。逆轉(zhuǎn)錄酶的用途①合成cDNA以oligodT為引物（與mRNA的polyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。3′AAAAAAAAAAAAAA5′mRNA5′TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-18反轉(zhuǎn)錄酶Mg2+dNTP3′AAAAAAAAAAAAAA5′mRNA5′TTTTTTTTTTTTTTTT3′cDNA當(dāng)前60頁(yè)，總共71頁(yè)。②合成cDNA雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈3′5′mRNA③RT-PCR用的模板克隆某個(gè)基因時(shí)，用其mRNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈。5′3′cDNA3′5′mRNA5′3′cDNA反轉(zhuǎn)錄酶5′3′cDNAklenow3′5′mRNA當(dāng)前61頁(yè)，總共71頁(yè)。（6）TaqDNA聚合酶1988年Saiki等從水生嗜熱桿菌中提取到一種耐熱TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀。該酶基因全長(zhǎng)2.49kb，編碼832個(gè)氨基酸。該酶雖然在90℃以上幾乎無(wú)DNA合成，但確有良好的熱穩(wěn)定性。（天然酶）TaqDNA聚合酶的熱穩(wěn)定性是該酶用于PCR反應(yīng)的前提條件，也是PCR反應(yīng)能迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的原因。當(dāng)前62頁(yè)，總共71頁(yè)。酶活性與熱穩(wěn)定性酶蛋白分子量94KDa，比活性200000∪/mg，Taq酶的濃度通常為1~2.5∪/l，太多浪費(fèi)并易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。熱穩(wěn)定性好：能耐受DNA變性時(shí)的高溫在92.5℃、95℃、97.5℃時(shí)，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分別經(jīng)130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。PCR反應(yīng)時(shí)變性溫度為95℃～20sec，50個(gè)循環(huán)后，TaqDNA聚合酶仍有65%的活性。當(dāng)前63頁(yè)，總共71頁(yè)。TaqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，對(duì)Mg2+濃度非常敏感。Mg2+濃度2.0mmol/L時(shí)，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。Mg2+能與dNTP結(jié)合而降低PCR反應(yīng)液中游離的Mg2+濃度，優(yōu)化濃度一般反應(yīng)中Mg2+濃度至少應(yīng)比dNTP總濃度高0.5～1.0mmol/L。適當(dāng)濃度的KCl能使Ta