基因工程備課

專題1基因工程選修3現(xiàn)代生物科技專題基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程20世紀中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破1.DNA是遺傳物質(zhì)的證明2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立3.遺傳密碼的破譯基因工程別名操作環(huán)境操作對象操作水平基本過程實質(zhì)結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導入→表達基因重組基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。按照人們意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，再放到另一種生物的細胞里，定向改造生物的遺傳性狀。基因工程的原理

讓目的基因在宿主細胞穩(wěn)定和高效地表達。具體的說，就是將外源基因通過體外重組后導入受體細胞，使這個基因能在受體細胞內(nèi)復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯的操作。基因重組的三種類型（能編碼蛋白質(zhì)）啟動子終止子外顯子內(nèi)含子（不能編碼蛋白質(zhì)）基礎(chǔ)鏈接——基因的結(jié)構(gòu)原核生物編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼蛋白質(zhì)調(diào)控遺傳信息的表達（調(diào)控程序）…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥G……T‥………TACACGTGCATCAAT………‥啟動子終止子真核生物編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGUUA

啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).

終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花轉(zhuǎn)入蘇云金桿菌的一個抗蟲基因，是中國目前最主要的轉(zhuǎn)基因作物。基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因與運載體DNA拼接導入棉花細胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)上述培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟是什么？關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來。關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與運載體DNA連接。關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因?qū)胧荏w（棉花）細胞。通過觀察抗蟲棉的培育過程，你認為關(guān)鍵的步驟是什么？關(guān)鍵步驟一的工具：基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶。關(guān)鍵步驟二的工具：基因的針線——DNA連接酶。關(guān)鍵步驟三的工具：基因的運輸工具——運載體。1.1DNA重組技術(shù)的基本工具基本工具：限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA連接酶——“分子縫合針”基因進入受體細胞的載體——“分子運輸車”識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要是從原核生物中分離純化出來的一種酶。能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進行的，故名限制性核酸內(nèi)切酶。4000種。1、來源：2、種類：3、作用：4、結(jié)果：形成兩種末端粘性末端平末端剪刀——限制性核酸內(nèi)切酶限制酶

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。

當限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。

限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線,中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復排列的。中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ排列的。用同一種限制性酶處理不同DNA片段，會形成同樣的黏性末端，可進行重組。為什么細菌中限制酶不剪切本身的DNA？因為微生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，對于外源入侵的DNA可以降解；含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，限制酶是原核生物的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，使之失效，達到保證自身的安全的目的。限制酶在原核生物中的作用是什么？作用部位：磷酸二酯鍵

DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個重組的DNA分子就形成了。針線——DNA連接酶DNA連接酶區(qū)別：E·coliDNA連接酶只能將雙鏈DNA片段互補的粘性末端之間連接起來，不能將雙鏈DNA片段平末端之間進行連接T4DNA連接酶既可“縫合”雙鏈DNA片段互補的黏性末端，又可以“縫合”雙鏈DNA片段的平末端，但連接平末端之間的效率比較低

DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？相同點：兩者都是形成磷酸二酯鍵。不同點：DNA連接酶:是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，不需要模板。DNA聚合酶:是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接到正在合成的DNA單鏈中，形成一條與模板鏈互補的DNA鏈；DNA聚合酶:是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接到正在合成的DNA單鏈中，形成一條與模板鏈互補的DNA鏈；滿足條件：（1）必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到運載體上去。（2）必需具備自我復制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制。（3）必需帶有標記基因，以便重組后進行重組DNA分子的辨認和篩選。（4）必需是安全的，不會對受體細胞有害，也就是能夠安全地“借居”在受體細胞中。（5）分子大小應適合，以便提取和在體外操作。運輸工具——運載體特別介紹：質(zhì)粒存在：主要存在于細菌的染色體以外。特性：是很小的環(huán)狀DNA分子，在細胞染色體外能夠自我復制。常用運載體：質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動植物病毒大腸桿菌質(zhì)粒的分子結(jié)構(gòu)示意圖實際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作。1、目的基因的獲取2、基因表達載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、提取目的基因的途徑人工合成基因（真核細胞）反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸序列合成DNA從供體細胞的DNA中直接分離基因

從基因文庫中獲取目的基因

基因文庫

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫基因組文庫

包含了一種生物所有的基因,部分基因文庫

包含了一種生物的一部分基因(1)從基因文庫中獲取目的基因基因組文庫的建立方法提取某種生物的全部DNA用適當?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與運載體連接導入受體菌中儲存基因組文庫方法介紹：(鳥槍法)②在細胞質(zhì)中將mRNA分離并加入反轉(zhuǎn)錄酶③合成第二條DNA鏈外顯子內(nèi)含子外顯子外顯子內(nèi)含子真核細胞的基因①在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA②在核內(nèi)內(nèi)含子被切去，外顯子彼此連接③在細胞質(zhì)中將mRNA分離并加入反轉(zhuǎn)錄酶④合成第二條DNA鏈基因的cDNA不含內(nèi)含子mRNA原核細胞的基因①在細胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄基因組文庫和cDNA文庫的主要區(qū)別

文庫類型cDNA文庫

基因組文庫

文庫大小基因中啟動子基因中內(nèi)含子

基因多少

物種間的基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以怎樣從基因文庫中找到我們所需要的目的基因

根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，例如，根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA，以及基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。（2）應用PCR技術(shù)擴增目的基因①定義：②原理：DNA復制PCR是聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)，在短時間內(nèi)大量擴增目的基因DNA分子熱變性（在90～95OC時，解旋，雙鏈分開溫度降低又結(jié)合成雙鏈）因此，在PCR技術(shù)中不需要解旋酶（與復制不同之在處)③儀器：PCR擴增儀（自動調(diào)控溫度的儀器）④條件：有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物，脫氧核苷酸，酶等。

過程變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補部位相配對和結(jié)合延伸：加熱至70～75℃以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈變性退火延伸（3）用化學方法直接人工合成目的基因①反轉(zhuǎn)錄法mRNA→RNA與DNA雜交鏈→單鏈DNA→雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸酶HDNA聚合酶cDNA②化學合成法氨基酸序列→mRNA序列→目的基因序列→目的基因推測合成思考：

不具有，缺少非編碼區(qū)(啟動子、終止子）和非編碼序列（如內(nèi)含子），要人工構(gòu)建。人工合成的目的基因是否具有完整基因結(jié)構(gòu)的基因？推測二、基因表達載體的構(gòu)建——核心（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。（2）用___________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同1.過程:2、基因表達載體的作用a、使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時使目的基因能表達和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達；（2）通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄；（3）目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；（4）有時需要確定目的基因表達的產(chǎn)物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。3.基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因位于基因的首端,是RNA聚合酶結(jié)合位點位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導入受體細胞e、復制原點轉(zhuǎn)錄和復制的起點尋根問底：

將生物的所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，結(jié)果會怎樣？

有人采用總DNA注射法進行遺傳轉(zhuǎn)化：即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導入受體細胞，沒有進行表達載體的構(gòu)建。

這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什么基因?qū)肓耸荏w細胞。此法目前爭議頗多，嚴格來說不算基因工程。資料:

科學家在培育抗蟲棉時，起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。

然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因啟動子，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力?？茖W家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因終止子，導入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。資料證明：載體構(gòu)建組成要完整三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1.轉(zhuǎn)化：

目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的工程2.常見轉(zhuǎn)化方法：（1）將目的基因?qū)胛⑸锛毎惺軕B(tài)細胞法。①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：雙子葉植物和裸子植物。（2）將目的基因?qū)胫参锛毎刍驑尫ǎ簡巫尤~植物。②花粉管通道法：雙子葉植物?！@微注射法。（3）將目的基因?qū)雱游锛毎鄢Ｓ梅ǎ孩诔Ｓ镁孩傥⑸镒魇荏w細胞原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少④過程：大腸桿菌Ca2+處理獲得感受態(tài)細胞Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)

細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞

吸收DNA___感受態(tài)細胞法：（1）將目的基因?qū)胛⑸锛毎?/p>

若通過基因過程生產(chǎn)人的糖蛋白可以用大腸桿菌作為工程菌嗎？

不可以，糖蛋白上的糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在真核細胞中，大腸桿菌是原核生物，細胞中不含這兩種細胞器。以酵母菌作為工程菌可以嗎?可以，酵母菌為真核生物（真菌類）。1、將目的基因?qū)胫参锛毎?）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法特點:能感染雙子葉植物和祼子植物,對單子葉植物無感染能力Ti質(zhì)粒的T—DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞并整合到其染色體上轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色DNA表達新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌脫分化組織培養(yǎng)脫分化農(nóng)桿菌導入植物細胞通過組織培養(yǎng)產(chǎn)生新個體再分化移植個體生物學水平的鑒定如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達導入植物細胞組織培養(yǎng)

植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。滴加目的基因溶液花粉通道法——簡便經(jīng)濟適用于被子植物胚珠花藥花絲柱頭花柱子房壁子房雄蕊雌蕊子房的結(jié)構(gòu)子房壁珠被珠心（胚囊）胚珠卵細胞極核

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法?；驑尫ㄟm用于單子葉植物①細胞類型：②操作程序：___顯微注射法：（3）將目的基因?qū)雱游锛毎l(fā)育成新性狀動物移植到子宮或輸卵管培養(yǎng)成早期胚胎顯微注射取受精卵提純含目的基因表達載體受精卵四、目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功導入完成后，真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。目的基因進入受體細胞后，不一定都能穩(wěn)定維持和表達，需要檢測①導入檢測：目的基因是否導入受體細胞檢測②表達檢測方法——轉(zhuǎn)錄檢測——分子雜交翻譯檢測——抗原抗體雜交DNA分子雜交分子檢測法鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等個體水平的鑒定1.檢測轉(zhuǎn)基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術(shù)變性變性變性方法——DNA分子雜交技術(shù)（2）檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針15N15N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA14N14N提取（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)證明：提取蛋白質(zhì)與Bt毒素蛋白質(zhì)一樣例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。2.鑒定——個體生物學水平的鑒定（1）多細胞個體抗蟲、抗病結(jié)種實驗，活性比較實驗不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。無表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物有表達產(chǎn)物無表達產(chǎn)物細菌的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)物的菌落，保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、研究。（2）單細胞生物基因工程的成果與發(fā)展前景基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生生產(chǎn)基因工程藥品用于基因診斷與基因治療基因工程與農(nóng)牧業(yè)、食品工業(yè)培育高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和具有優(yōu)良品質(zhì)的動植物新品種培育具有各種抗逆性的動植物新品種為人類開辟新的食物來源基因工程與環(huán)境保護用于環(huán)境監(jiān)測用于被污染環(huán)境的凈化基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生1、基因工程藥品的生產(chǎn)微生物生長迅速，易控制，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。項目本質(zhì)功能傳統(tǒng)方法現(xiàn)代方法胰島素干擾素（、、）乙型疫苗蛋白質(zhì)治療糖尿病動物胰臟中提取大腸桿菌細胞糖蛋白治療病毒性肝炎和腫瘤人血液中提取酵母菌細胞乙肝抗原預防乙肝酵母菌細胞

治療侏儒癥的唯一方法，是向人體注射生長激素。而生長激素的獲得很困難。以前，要獲得生長激素，需解剖尸體，從大腦的底部摘取垂體，并從中提取生長激素?，F(xiàn)可利用基因工程方法，將人的生長激素基因?qū)氪竽c桿菌中，使其生產(chǎn)生長激素。人們從450L大腸桿菌培養(yǎng)液中提取的生長激素，相當于6萬具尸體的全部產(chǎn)量?；蚬こ趟幬铩L激素基因工程藥物的優(yōu)點：大批量，成本低DNA分子雜交技術(shù)

該方法是根據(jù)堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學發(fā)光催化劑等進行標記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。2、基因診斷：基因工程與醫(yī)藥衛(wèi)生1）白血病患者細胞中分離出的癌基因制備的DNA探針→白血病2）β—珠蛋白的DNA探針→鐮刀狀細胞貧血癥3）苯丙氨酸羧化酶基因探針→苯丙酮尿癥

基因診斷舉例：生物芯片從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出標準圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖譜。通過比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息?；蛐酒\斷技術(shù)以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟、平行化、自動化等特點，將成為一項現(xiàn)代化診斷新技術(shù)?；蚬こ膛c醫(yī)藥衛(wèi)生3、基因治療基因治療是把健康的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募毎?，達到治療疾病的目的。取患者骨髓分離干細胞病毒正常基因并入正?；虻母杉毎⑷牖颊唧w內(nèi)體內(nèi)基因治療體外基因治療1）乳腺是一個外分泌器官，乳汁不進入體內(nèi)循環(huán)，不會影響轉(zhuǎn)基因動物本身的生理代謝反應。2）從乳汁中獲取目的基因產(chǎn)物，產(chǎn)量高，易提純，表達的蛋白質(zhì)已經(jīng)過充分的修飾加工，具有穩(wěn)定的生物活性。3）從乳汁中源源不斷獲得目的基因的產(chǎn)物的同時，轉(zhuǎn)基因動物又可無限繁殖。動物哪個結(jié)構(gòu)是基因藥物最理想的表達場所呢？乳腺——乳房生物反應器膀胱——膀胱生物反應器轉(zhuǎn)基因植物（1）生產(chǎn)過程：（2）優(yōu)點：（3）實例：農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)，緩解了糧食短缺縮短了育種時間，克服了遠緣親本難雜交的特點抗除草劑的轉(zhuǎn)基因煙草、抗蟲棉抗病毒