CHIP染色質(zhì)免疫共沉淀實驗方法簡介

CHIP染色質(zhì)免疫共沉淀實驗方法簡介第1頁/共16頁基因表達(dá):反式因子和順式作用元件之間相互作用。

真核生物的基因組DNA以染色質(zhì)的形式存在。研究蛋白質(zhì)與DNA在染色質(zhì)環(huán)境下的相互作用是闡明真核基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑。概述原理方法比較舉例基因表達(dá)調(diào)控功能基因組學(xué)第2頁/共16頁染色質(zhì)免疫沉淀實驗(CHIP)研究體內(nèi)DNA－蛋白質(zhì)相互作用的重要工具。它不僅可以靈敏地檢測目標(biāo)蛋白與特異DNA片段的結(jié)合情況，還可以用來研究組蛋白與基因表達(dá)的關(guān)系。概述原理方法比較舉例第3頁/共16頁CHIP原理在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段對目的片斷的純化與檢測概述原理方法比較舉例第4頁/共16頁概述原理方法比較舉例第5頁/共16頁操作步驟一、固定

在活細(xì)胞狀態(tài)下，用甲醛固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，然后用化學(xué)（微球菌酶）或者機(jī)械（超聲波）的手段將其隨機(jī)切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段。二、免疫沉淀

利用目的蛋白質(zhì)的特異抗體通過抗原-抗體反應(yīng)形成DNA-蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合體，然后沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。三、純化與檢測

經(jīng)蛋白質(zhì)與DNA解偶聯(lián)，DNA片段純化等處理后，用PCR等方法檢測DNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況.概述原理方法比較舉例第6頁/共16頁概述原理方法比較舉例第7頁/共16頁注意事項超聲波破碎條件的選擇抗體量的選擇PCR反應(yīng)條件的選擇概述原理方法比較舉例Input對照陽性對照：如組蛋白抗體陰性對照：陰性引物條件選擇對照設(shè)置第8頁/共16頁比較：蛋白質(zhì)-DNA相互作用常用方法凝膠電泳遷移率改變分析

（EMSA）DNaseⅠ足跡法（footprinting）染色質(zhì)免疫沉淀實驗(CHIP)體內(nèi)體外概述原理方法比較舉例第9頁/共16頁EMSACHIP由于許多轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白有相似或相同的DNA結(jié)合位點，EMSA獲取的結(jié)果不一定能真實地反映體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和DNA結(jié)合的狀況。能真實完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白，是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的最好方法。概述原理方法比較舉例第10頁/共16頁應(yīng)用舉例概述原理方法比較舉例MantovaniF,ToccoF,GirardiniJ,etal.TheprolylisomerasePin1orchestratesp53acetylationanddissociationfromtheapoptosisinhibitoriASPP.NatStructMolBiol.2007Oct;14(10):912-920.第11頁/共16頁概述原理方法比較舉例SalehA,Alvarez-VenegasR,AvramovaZ.Anefficientchromatinimmunoprecipitation(ChIP)protocolforstudyinghistonemodificationsinArabidopsisplants.NatProtoc.2008;3(6):1018-1025.第12頁/共16頁擴(kuò)展應(yīng)用舉例CHIP-on-chip概述原理方法比較舉例第13頁/共16頁ChiSW,ZangJB,MeleA,DarnellRB.ArgonauteHITS-CLIPdecodesmicroRNA-mRNAinteractionmaps.Nature.2009Jul23;460(7254):479-486.概述原理方法比較舉例crosslinkingimmunoprecipitation(CLIP)FormicroRN