DNA分子標(biāo)記的資料

DNA分子標(biāo)記的資料第1頁/共50頁RAPDRAPD

randomamplifiedpolymorphicDNA Williamsetal.1990原理：隨機(jī)擴(kuò)增 引物：任意序列的10個(gè)堿基的寡核苷酸 片段 模板：未知序列的基因組DNA3/50第2頁/共49頁第2頁/共50頁4/50第3頁/共49頁第3頁/共50頁RAPD實(shí)驗(yàn)流程

DNA提取

PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物檢測 數(shù)據(jù)記錄 5/50第4頁/共49頁第4頁/共50頁RAPD很難判斷帶的有無背景影響嚴(yán)重Ｑ：帶的亮度差異很大？凝膠分辨率？6/50第5頁/共49頁第5頁/共50頁RAPD7/50第6頁/共49頁第6頁/共50頁RAPD陰性對照出帶陽性對照where8/50第7頁/共49頁第7頁/共50頁RAPD反應(yīng)體系BufferMg2+dNTPDNA聚合酶引物DNAH2OMg2+濃度較高核酸外切酶活性較低單引物，序列短純度，濃度純度9/50第8頁/共49頁第8頁/共50頁RAPD反應(yīng)條件94℃36℃72℃

引物退火溫度太低 循環(huán)次數(shù)10/50第9頁/共49頁第9頁/共50頁RAPD陰性對照陽性對照 可重復(fù)性11/50第10頁/共49頁第10頁/共50頁RAPD數(shù)據(jù)記錄

0–1矩陣

顯性標(biāo)記有有有有無有１１１１０１12/50第11頁/共49頁第11頁/共50頁RAPD缺陷

可重復(fù)性低

顯性標(biāo)記13/50第12頁/共49頁第12頁/共50頁RAPDRAPD

randomamplifiedpolymorphicDNA 10堿基 Williamsetal.1990AP-PCR arbitraryprimerPCR 20,30堿基 Welshetal.1990DAF DNAamplificationfingerprinting 5,8個(gè)堿基 Caetano-Anollesetal.199114/50第13頁/共49頁第13頁/共50頁

隨機(jī)擴(kuò)增

RAPD,ISSR,

單核苷酸突變檢驗(yàn)

SNP

限制性酶切

RFLP,PCR-RFLP,TRFP15/50第14頁/共49頁第14頁/共50頁ISSRISSR

inter-simplesequencerepeat

Zietkiewiczetal.1994原理：隨機(jī)擴(kuò)增 引物：20bp左右

5’-BDB(ACA)5-3’16/50第15頁/共49頁第15頁/共50頁17/50第16頁/共49頁第16頁/共50頁ISSR50mMofKCl,1.5mMofMgCl2,0.25mMofdNTPs,

2%formamide,0.2μMofprimer,0.5mMofspermidine,0.8Uof

TaqDNApolymeraseenzyme(BangloreGenei,India)and20ng

ofDNAper25μlreactionInitialdenaturationfor

5minat94°C,eachcyclecomprised1-mindenaturationat94°C,

45sannealingat49°C,2-minextensionat72°Cwithafinalextension

for5minat72°Cattheendof45cycles.Mostofthepatternswithextremely

goodpolymorphismandusefulinformationwereoftenaccompanied

withabackgroundsmear.Toreducethissmear,2%formamide

wasusedinthereaction.Allthepatternsgeneratedwere

repeatedatleastthreetimesinordertoobtainreproducibledata.Joshietal.2000TheorApplGenet100:131118/50第17頁/共49頁第17頁/共50頁ISSR19/50第18頁/共49頁第18頁/共50頁ISSR可重復(fù)性高于RAPD隨機(jī)擴(kuò)增顯性標(biāo)記20/50第19頁/共49頁第19頁/共50頁SNPSNP singlenucleotidepolymorphisms 5’–GGATCAGTACTGACTCAG–3’ 5’–GGATCAGTAATGACTCAG–3’21/50第20頁/共49頁第20頁/共50頁SNPSNP變異來源轉(zhuǎn)換transition

一種嘧啶置換另一種嘧啶C?T

一種嘌呤置換另一種嘌呤A?G

顛換transversion

嘌呤與嘧啶互換，C?A，A?T等缺失/插入

22/50第21頁/共49頁第21頁/共50頁SNP的檢測方法23/50第22頁/共49頁第22頁/共50頁SNP檢測－SNaPshot24/50第23頁/共49頁第23頁/共50頁SNP檢測－SNaPshot單引物擴(kuò)增25/50第24頁/共49頁第24頁/共50頁多重PCR:

multiplexprimersextensionarraysSNP檢測－

SNaPshot26/50第25頁/共49頁第25頁/共50頁SNP檢測－突變錯(cuò)配擴(kuò)增檢驗(yàn)180bp210bp共顯性標(biāo)記27/50第26頁/共49頁第26頁/共50頁SNP優(yōu)點(diǎn)特異性的共顯性基因有功能意義缺點(diǎn)引物設(shè)計(jì)困難28/50第27頁/共49頁第27頁/共50頁顯性與共顯性23411112101180bp210bpRAPD顯性1231AAABBBSNP共顯性29/50第28頁/共49頁第28頁/共50頁花柱卷曲性的適應(yīng)意義AAControlCutaaAAAAAa共顯性標(biāo)記的應(yīng)用30/50第29頁/共49頁第29頁/共50頁顯性標(biāo)記的應(yīng)用種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)2345611011121111031000131/50第30頁/共49頁第30頁/共50頁隨機(jī)擴(kuò)增與特異性擴(kuò)增可重復(fù)性——數(shù)據(jù)的可靠性有條帶無條帶特異性擴(kuò)增擴(kuò)增成功擴(kuò)增不成功非特異性擴(kuò)增擴(kuò)增成功？32/50第31頁/共49頁第31頁/共50頁

隨機(jī)擴(kuò)增

RAPD,ISSR,

單核苷酸突變檢驗(yàn)

SNP

限制性酶切

RFLP,PCR-RFLP,TRFP33/50第32頁/共49頁第32頁/共50頁RFLPRLFP restrictionfragmentlengthpolymorphism原理

限制性內(nèi)切酶消化獲得的DNA片段大小的變異780bp470bp310bp34/50第33頁/共49頁第33頁/共50頁RFLP研究的發(fā)展基因組DNA酶切對象PCR產(chǎn)物末端熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物RFLPPCR-RFLPTRFP35/50第34頁/共49頁第34頁/共50頁RFLP實(shí)驗(yàn)流程DNA提取限制性內(nèi)切酶消化電泳分離放射自顯影檢測36/50第35頁/共49頁第35頁/共50頁RFLP限制性內(nèi)切酶的選擇已經(jīng)分離鑒定了數(shù)千種近千種已用于商業(yè)流通37/50第36頁/共49頁第36頁/共50頁38/50第37頁/共49頁第37頁/共50頁RFLP放射自顯影檢測為什么要采用放射自顯影檢測？Southern雜交 探針？39/50第38頁/共49頁第38頁/共50頁RFLPpatternsinP.densata40/50第39頁/共49頁第39頁/共50頁RFLP顯性標(biāo)記or共顯性標(biāo)記41/50第40頁/共49頁第40頁/共50頁P(yáng)CR-RFLP實(shí)驗(yàn)流程DNA提取目的片段擴(kuò)增（1–3kb,<30kb）限制性內(nèi)切酶消化電泳分離EB染色或銀染42/50第41頁/共49頁第41頁/共50頁P(yáng)CR-RFLP目的片段擴(kuò)增長度 Barnes1994PNAS來源 nrDNA,cpDNA,ormtDNA酶切位點(diǎn)43/50第42頁/共49頁第42頁/共50頁P(yáng)CR-RFLPBsp1286IRsaIHincIIScaIMboIIRsaI44/50第43頁/共49頁第43頁/共50頁Geetal.2001.Genome44:

1136-1142IdentificationofricegenomesbyPCR-RFLPofAdhgenes45/50第44頁/共49頁第44頁/共50頁TRFP

Terminalrestrictionfragmentpatterns實(shí)驗(yàn)流程DNA提取目的片段擴(kuò)增（1–3kb,<30kb）

引物末端熒光標(biāo)記，F(xiàn)AM限制性內(nèi)切酶消化毛細(xì)管電泳分離測序儀自動檢測分析46/50第45頁/共49頁第45頁/共50頁TRFP47/50第46頁/共49頁第46頁/共50頁Ordereddatavs.UnordereddataOrdereddata：能夠從現(xiàn)有基因型或者h(yuǎn)aplotype(多位點(diǎn)基因型)推測祖先型的數(shù)據(jù)

cpDNAPCR-RFLPS1S2S3S1S2S3S1S2S348/50第47頁/共49頁第47頁/共50頁Ordereddatavs.UnordereddataOrdereddata DNAsequencesdataS1S2S3S1:5’–GGATCATGTCTGACAGCTACTGGTAATG–3’S2:5’–GGATTATGTCTGACAGCTACTGGTAATG–3’S3:5’–GGATT