基因工程抗體片段

關(guān)于基因工程抗體片段第一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日基因工程抗體片段之前奏曲

———小分子抗體第二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日

第一代小分子抗體———抗原結(jié)合片段(fragmentwithantigenbinding，F(xiàn)ab)和重組FabFab片段由完整輕鏈和重鏈的VH+CH1構(gòu)成，其大小為完整抗體的1/3,約55KD；重組Fab是將輕、重鏈可變區(qū)分別與人抗體的κ鏈和重鏈CH1重組；第三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日

Fab基因工程構(gòu)建方法及其性能通常是保留鼠源性的CDR區(qū),其余換成人源化,通過大腸桿菌以分泌表達(dá)的方式表達(dá)L鏈和Fd鏈,二者能在細(xì)菌的外周質(zhì)腔中折疊成具有一定構(gòu)象的Fab；該Fab具有抗體的活性。因為其不含有Fc段、分子量小、結(jié)合力高、抗原性低,故在腫瘤治療上有其優(yōu)越性。目前已有多個片段藥物獲得FDA批準(zhǔn)上市.

第四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日Fab的臨床應(yīng)用1）阿昔單抗(abciximab，ReoPro)1994年12月FDA批準(zhǔn)的第一個重組Fab片段，該產(chǎn)品以血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa為靶點，用以防止血小板聚集及血栓形成，作為冠狀動脈導(dǎo)管插術(shù)時預(yù)防心肌缺血的輔助用藥，取得了巨大的成功；2）蘭尼單抗(lucentis)：治療黃斑變性，2006年獲得FDA的批準(zhǔn)。3）賽妥珠單抗(cimzia)：克羅恩病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，2008年獲得FDA的批準(zhǔn)。在臨床研究中，F(xiàn)ab占據(jù)了臨床研發(fā)抗體片段的大多數(shù)(30/54種)。第五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日第二代小分子抗體———單鏈抗體(singlechainFv，ScFv)ScFv指在重鏈V區(qū)cDNA5’端與輕鏈V區(qū)cDNA5’端之間用一寡聚核甘酸連接,在大腸桿菌中表達(dá)成一單鏈多肽,并在細(xì)菌體內(nèi)折疊成只由重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)成的一種新型的抗體,大小僅為完整Ig的1/6(約28KD);是含有完整抗原結(jié)合部位的最小抗體片段；第六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日ScFV的功能1）用于治療：可進(jìn)人一般抗體不能達(dá)到的部位,如蛋白偶聯(lián)受體、酶活性部位和病毒表面的腔囊等；2）多肽接頭可設(shè)計為具有特殊功能的位點：多肽接頭是單鏈抗體的獨特組成,可設(shè)計為具有特殊功能的位點：如金屬贅合、連接毒素或藥物等,用于影像和臨床治療；第七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日第三代小分子抗體———納米抗體和分子識別單位(molecularrecognitionunit，MRU)1.納米抗體主要指僅由一個重鏈可變區(qū)組成的單域抗體(VHH)，其體積約為完整抗體的1/10，故稱為納米抗體；第八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日納米抗體的來源

1993年Hamers等偶然發(fā)現(xiàn)駱駝體內(nèi)存在一種僅具有重鏈的抗體，被稱為重鏈抗體(heavy-chainantibodies，HCAbs)。此后，在一些軟骨魚，如護(hù)士鯊體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)類似駱駝重鏈抗體結(jié)構(gòu)的新抗原受體(newantigenreceptor，NAR)。這類抗體的抗原結(jié)合位點僅由重鏈的可變區(qū)VHH(variabledomainoftheheavychainofHCAbs，VHH)單結(jié)構(gòu)域形成，盡管缺失輕鏈可變區(qū)，卻仍具有良好和廣泛的抗原結(jié)合力；克隆這種抗體重鏈的可變區(qū)，構(gòu)建僅由一個重鏈可變區(qū)組成的單域抗體(VHH)。第九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日第十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日納米抗體單域的性質(zhì)1）有高度水溶性和構(gòu)象穩(wěn)定性：盡管缺失輕鏈可變區(qū)，卻仍具有良好和廣泛的抗原結(jié)合力。并且由于在框架FR2區(qū)存在一些不同于常規(guī)抗體的親水性氨基酸，使得VHH抗體在水溶液中具有良好的穩(wěn)定性。在苛刻的條件中，如胃液和內(nèi)臟中仍能保持抗原結(jié)合活性，為口服治療胃腸道功能紊亂性疾病提供新的思路；第十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日2）納米抗體能識別獨特的抗原表位，由于具有伸展的抗原互補結(jié)合區(qū)(CDR)以及更高的組織穿透性和更小的分子，VHH抗體可以結(jié)合一些常規(guī)抗體無法接近的抗原表位?？蛇M(jìn)入酶的活性部位及細(xì)菌或病毒表面受體裂縫中，可以利用其模擬藥物來設(shè)計小分子酶的抑制劑、受體的激動劑或拮抗劑等；3）能有效地穿過血腦屏障：有望成為治療神經(jīng)性疾病和腦腫瘤的新藥第十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日VHH穩(wěn)定的機制傳統(tǒng)抗體的VH和VL區(qū)通過疏水作用形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，而重鏈抗體則通過選擇性突變VHH胚系基因中幾個功能位點，使其形成較高的親水性表面，可在缺失VL條件下保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；第十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日第十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日VHH胚系基因序列特性1）對駱駝VHH胚系基因序列分析發(fā)現(xiàn)，VHH與人源VH基因Ⅲ家族序列具有較高的同源性；第十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日2）比較人類和駱駝IgG重鏈可變區(qū)發(fā)現(xiàn)，在框架FR2區(qū)的氨基酸組成中，有4個氨基酸顯著不同。這4個氨基酸在VH和VHH中分別是V42F或V42Y，G49E，L50R和W52G，，第十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日利用這一特點,可以對人源抗體VH結(jié)構(gòu)域FR2中的一些氨基酸進(jìn)行VHH特征性改造,所得到的駱駝化單域VH抗體不僅保持原有的抗體的特異性和親和力,而且溶解性好、穩(wěn)定性好。第十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日2.分子識別單位(molecularrecognitionunit，MRU)MRU是由單個互補決定區(qū)組成的小分子抗體片段，約為完整抗體分子的1/80～1/70。

MRU也具有與抗原結(jié)合的能力，且由于其穿透力強、半衰期短、顯像時本底低，在臨床診斷中具有潛在的應(yīng)用前景。第十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日基因工程抗體片段之進(jìn)行曲———抗體片段的改造和改型第十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日通過對小分子抗體基因的改造和修飾，改善其親和力、免疫原性及效應(yīng)，構(gòu)建出多種基因工程抗體片段.目前已有54種基因工程抗體片段進(jìn)入臨床研究，其中30種源自Fab(56%)、19種源自ScFv(35%)、5種源自第三代小分子抗體(9%)第二十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日1.雙鏈抗體Diabody第二十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日設(shè)計背景由于單價抗體片段(如ScFv、Fab)與靶抗原作用后保留時間短且解離速度快,所以在實際應(yīng)用中有必要設(shè)計多價抗體分子,這種多價分子可顯示出與抗原更加強的親和力和慢的解離速度；第二十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日Fab和ScFv片段能夠通過化學(xué)的或基因工程linker構(gòu)成二聚體、三聚體或四聚體。例如Fab就被用化學(xué)連成二價或三價的多聚體,實驗表明其與抗原的保持性有所提高；第二十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日第二十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日最成功的設(shè)計縮短Linker二價雙鏈抗體ScFV0—5個氨基酸第二十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日2.雙特異性抗體(bispecificantibody，BsAb)第二十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日一個結(jié)合靶細(xì)胞上的特異性抗原另一個結(jié)合淋巴細(xì)胞或吞噬細(xì)胞等效應(yīng)物雙特異性抗體的2個抗原結(jié)合部位兩條抗原結(jié)合臂可分別來自FV段、Fab段、ScFV或dsFv導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞靶向殺滅腫瘤細(xì)胞有二價、四價、六價第二十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日第二十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日第二十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日雙特異抗體的設(shè)計和運用化學(xué)交聯(lián)：分別分離純化兩種親本單抗，采用還原劑使其解鏈，獲得單價抗體，再采用異雙功能交聯(lián)劑，把兩種具有不同抗原特異性的單價抗體或其片段交聯(lián)起來；細(xì)胞工程：采用細(xì)胞融合的方法，將分泌單抗的雜交瘤與經(jīng)免疫的脾細(xì)胞結(jié)合，或者使兩種分泌不同單抗的雜交瘤細(xì)胞融合；基因工程：多采用抗體分子片段，F(xiàn)ab、ScFV等經(jīng)過基因操作修飾后，通過體外組裝成BsAb或者直接表達(dá)分泌型的BsAb第三十頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日Amajorityofbothbispecificdiabodiesandbis-scFvaredesignedtobindtotheCD3T-cellcoreceptorandtherebyrecruitcytotoxicT-cells(CTLs)tothetumorsite.第三十一頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日雙特異抗體的臨床優(yōu)勢1）靶向性好：用高價BsAb靶向目標(biāo)抗原可使藥物選擇性地結(jié)合到高抗原密度的腫瘤組織區(qū)，正常組織抗原密度低于BsAb的結(jié)合域值，因而BsAb極少滲透入正常組織，從而提高了BsAb的靶向性；。實例：Lu等設(shè)計了3價抗ErbB2/CD16的BsAb，它包括2個結(jié)合ErbB2的ScFv形式結(jié)合位點和一個定位于NK細(xì)胞的單價Fab片段位點；第三十二頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日2）是一種有效的抗腫瘤策略：Michaelson等將抗LTβR的ScFv片段融合于抗TRAIL-R2單抗的重鏈端，設(shè)計了以TNF家族膜受體TRAIL-R2和LTβR為靶點的IgG樣BsAb。該抗體血漿半衰期長，體外實驗中能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，在小鼠腫瘤移植模型中較之親本抗體能更顯著地減小腫瘤體積；第三十三頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日3）具有更強的殺傷淋巴瘤細(xì)胞的功效，且對同體正常B細(xì)胞的作用較弱：Rossi等報道了一對來自抗CD20IgG1κ)和依帕珠單抗(epratuzumab)的人源化6價抗CD20/22的BsAb———20-22和22-20。它們無需第二抗體交聯(lián)即可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和增殖抑制第三十四頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日2.小分子抗體與其他分子連接成融合物第三十五頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日與毒素的連接將抗體片段與細(xì)菌或植物毒素連接,使其具有特異性的識別腫瘤細(xì)胞的功能,并利用毒素來殺傷腫瘤細(xì)胞；如DiPaolo等曾將人源化的抗Ep一CAM的單鏈抗體4D5MOCB與綠膿假單胞外毒素A融合,發(fā)現(xiàn)其優(yōu)先定位在Ep一CAM陽性的腫瘤細(xì)胞,并能抑制多種腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長,顯示了良好的應(yīng)用前景。第三十六頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日與細(xì)胞因子連接將抗體片段與IL-2、IL-12或GM一CSF等免疫刺激因子結(jié)合成融合蛋白后,能刺激細(xì)胞增殖,能促使自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生溶瘤細(xì)胞作用;第三十七頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日其他形式的免疫結(jié)合物1）放射性標(biāo)記的抗體片段：，通過抗體特異性的識別作用使放射性物質(zhì)有效地導(dǎo)向腫瘤組織局部，用于放射免疫治療;2）抗體-化療藥物結(jié)合物：通過化學(xué)方法使抗體和化療藥物的某些基團偶聯(lián)，在特異的作用位點產(chǎn)生細(xì)胞毒作用進(jìn)行免疫化療;第三十八頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日3）抗體-酶連接物：利用抗體導(dǎo)向作用，將催化前體藥物的酶攜帶至腫瘤局部，待血液循環(huán)及正常組織中非特異分布的抗體酶藥物廓清后再注射前體藥物，在腫瘤局部造成高濃度化療藥物的微環(huán)境，從而高效率殺傷腫瘤細(xì)胞。第三十九頁，共四十二頁，編輯于2023年，星期日4.細(xì)胞內(nèi)抗體將小分子抗體基因加上定位信號序列，使其在細(xì)胞內(nèi)特定部位表達(dá)，可中和或調(diào)節(jié)位于特定亞細(xì)胞部位的活性分子或者觸發(fā)免疫反應(yīng)，即為細(xì)胞內(nèi)抗體(