單基因遺傳病的研究方法與技術

關于單基因遺傳病的研究方法與技術第一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日已知致病基因突變分析第二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日基因突變第三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日基因突變穩(wěn)定突變：傳遞中不改變原有的突變。動態(tài)突變：傳遞中不斷改變自己，多見于短重復序列的突變，在一代代傳遞中重復次數(shù)發(fā)生明顯變化。

第四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日三核苷酸重復突變第五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日基因突變類型點突變：只有一個或幾個核苷酸的改變，是突變中最多見的形式。突變的結(jié)果分為：

同義突變、錯義突變、無義突變、剪切突變等。堿基的插入和缺失：基因編碼序列中插入或丟失一個或幾個堿基，其結(jié)果是突變點下游堿基序列發(fā)生移碼，編碼氨基酸序列都發(fā)生改變，又稱移碼突變（frameshiftmutation），并可在突變點下游提前出現(xiàn)終止密碼。第六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日基因突變類型框內(nèi)突變（inframemutation）：3個或是3的倍數(shù)的堿基缺失或插入導致的突變，使基因丟失或增加1個或幾個氨基酸。DNA大片段缺失或復制（largedeletionorduplication)：幾百個bp至幾十個kb的堿基缺失或復制。

第七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日各種類型病理性突變的比例無義突變和移碼突變：60％稀有的錯義突變：20％DNA大片段缺失或重復:20％微小突變第八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日基因突變分析所用實驗材料臨床樣本取材：外周血組織毛囊頰粘膜脫落細胞羊水細胞絨毛實驗應用材料：DNARNAProtein第九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日RNA的優(yōu)點與缺點優(yōu)點:

不包含內(nèi)含子RT-PCR能夠檢測異常的剪切體缺點:

不易獲得

要求操作特別小心且快速以免降解目的基因可能不在獲得的材料組織中表達

導致RNA不穩(wěn)定的突變不能被檢測第十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日聚合酶鏈式反應分子雜交基因突變分析常用技術第十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日Southern印跡雜交第十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日例如：脆X綜合征若X染色體在Xq27.3處呈現(xiàn)細絲樣結(jié)構(gòu)，且連接的末端形似隨體，這條染色體就被稱為脆性X染色體。主要臨床癥狀：智力低下、語言障礙、性格孤僻、伴有特殊面容——長臉、方額、大耳朵、嘴大唇厚，青春期后可見明顯大于正常的睪丸。通貫掌、三叉點C缺如。第十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日Xq27.3第十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日前突變和全突變正常

CGG<6-54前突變CGG55-200全突變CGG>200第十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日Southern雜交法診斷FragileXF:FullyexpandedandmethylatedNM:MethylatedXdonotcutwithEclXIP:UnmethylatedpremutationN:Xinnormalmaleandactivenormalfemale第十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日MullisF"forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method"聚合酶鏈式反應（PCR）聚合酶鏈式反應于1983年由美國Cetus公司的K.Mullis建立，并和定點突變的發(fā)明者M.Smith一起榮獲1993年度諾貝爾化學獎，為生命科學領域的研究開創(chuàng)了嶄新時代。第十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日PCR反應的特點特異性強引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實性靈敏度高指數(shù)增長，從pg(10-12)可擴增至mg(10-6)水平簡便、快速2～4小時完成擴增對標本的純度要求低

DNA粗制品及總RNA均可作為擴增模板第二十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日DNA的體外復制包括3個步驟：變性（denaturation）:94C~95C

退火（annealing）:40C~70C

延伸（extension）:72C

3個步驟作為PCR的一個循環(huán)，每當完成一個循環(huán)，一個分子的模板被復制為二個，產(chǎn)物量以指數(shù)形式增長。PCR反應原理和反應過程第二十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日5’5’3’3’d.NTPs耐熱DNA聚合酶引物5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’添加反應混合液及樣本變性5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’退火加入試管中第二十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日延伸5’3’5’3’5’3’5’3’繼續(xù)延伸5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’循環(huán)第二十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’第二個循環(huán)4個拷貝第三個循環(huán)8個拷貝5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’第n個循環(huán)2n個拷貝第二十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日PCR反應體系參與PCR反應的主要成份:模板、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。第二十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日引物(Primers)

引物決定PCR擴增產(chǎn)物的特異性和長度化學合成的寡核苷酸能與模板特異地結(jié)合引物決定產(chǎn)物的特異性和長度引物設計時必須遵循一些原則

第二十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日設計引物的原則：二條引物分別位于被擴增片段的兩端，與模板正負鏈序列互補長度為18~25個核苷酸二條引物之間避免形成引物二聚體引物的堿基組成應平衡引物的5`端可被修飾（引入酶切位點、引入突變位點、生物素等標記）第二十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日DNA聚合酶TaqDNA聚合酶復制的保真性：TaqDNA聚合酶無3’→5’外切酶活性，因而無校正功能，在復制新鏈的過程中會發(fā)生堿基錯配。TaqDNA聚合酶在每次循環(huán)中產(chǎn)生的移碼突變率為1/30000，堿基替換率為1/8000。第二十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日擴增失敗試劑錯加或漏加實驗中如發(fā)現(xiàn)對照樣本也擴增失敗，可用原試劑重復一次，以確定試劑是否錯加或漏加。試劑失效變性溫度偏低有些DNA所含G、C堿基對豐富，當變性溫度偏低時，雙鏈DNA不能完全解鏈。退火溫度偏高第二十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日標本中DNA含量過高或雜質(zhì)過多。降低加樣量拖尾可明顯改善。Taq酶加量過大或擴增循環(huán)數(shù)太多拖尾第三十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日非特異條帶退火溫度低,提高退火溫度。引物特異性不佳，切膠純化特異條帶Taq酶加量過大或擴增循環(huán)數(shù)太多第三十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日引物二聚體引物量過多：降低引物濃度。引物設計問題操作問題：反應體系建立后，如在室溫放置時間過長，會引起擴增后的二聚體加重。第三十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日應用PCR相關技術進行基因突變分析的策略與方法第三十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日策略與方法直接分析法：PCR片段大小分析：片段大小有明顯差異PCR-RFLP：有酶切位點PCR-測序：確定突變點堿基改變多重連接探針擴增（MLPA）：片段缺失與重復RT-PCR:

基因大，可取到新鮮材料，且基因在其中有表達間接分析法：PCR-STR連鎖分析：基因大；在已知致病基因編碼區(qū)未檢測到突變的家系第三十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日1.脊髓小腦性共濟失調(diào)脊髓小腦性共濟失調(diào)是遺傳性共濟失調(diào)的主要類型，包括SCA1－27。成年期發(fā)病、常染色體顯性遺傳及共濟失調(diào)等是本病的共同特征，并表現(xiàn)在連續(xù)數(shù)代中發(fā)病年齡提前和病情加重（遺傳早現(xiàn)）。SCA3是我國最常見的脊髓小腦性共濟失調(diào)亞型，基因位于14q24..3－32，含4個外顯子。CAG突變位于4號外顯子，患者擴增拷貝數(shù)為61－89，正常人為12－41。第三十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日

NCF1F2F3F4F5PCM應用PCR技術分析一遺傳性脊髓小腦性共濟失調(diào)（SCA)3型家系NC:正常對照PC:陽性對照F:家系成員M:Marker結(jié)果：家系成員1、3、4有SCA3致病基因突變;家系成員2、5未檢測到突變12345第三十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日2.脊肌萎縮癥脊肌萎縮癥(SpinalMuscularAtrophy,SMA)系指一類由于下運動神經(jīng)元變性導致的進行性骨骼肌無力和萎縮的一組疾病,是兒童和少年常見的致死性常染色體隱性遺傳病之一,其隱性致病基因攜帶率在人群中為1/40～1/50,發(fā)病率為1/6000～1/10000.第三十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日應用PCR-RFLP技術分析脊肌萎縮癥（SMA）致病基因SMNPCR擴增SMN基因exon7,DraI酶切PCR產(chǎn)物.酶切N：正常人PCR產(chǎn)物被酶切為兩條帶酶切P：陽性對照PCR產(chǎn)物被酶切為一條短帶病人1：結(jié)果顯示SMN基因有突變病人2和3：結(jié)果顯示未有突變第三十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日3.腓骨肌萎縮癥(CMT)CMT是一類周圍神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病,其遺傳方式可為常染色體顯性遺傳(AD,占絕大多數(shù))、常染色體隱性遺傳(AR)及X連鎖顯性遺傳(XD)依據(jù)病理和電生理特點分為兩型:脫髓鞘型(CMT1型)和軸突型(CMT2型).CMT1型約占CMT總數(shù)的70%，70%以上CMT1由PMP22基因重復引起其中X連鎖顯性遺傳CMT致病基因為CX32，含有2個外顯子第三十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日MLPA分析PMP22基因重復突變第四十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日PCR-測序直接分析CX32基因來診斷X連鎖腓骨肌萎縮癥第四十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日4.假肥大型肌營養(yǎng)不良癥

假肥大型肌營養(yǎng)不良(DMD)是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X染色體連鎖的遺傳性疾病，在2500個活產(chǎn)男嬰中即有一個患者致病基因DMD含有79個外顯子

DMD的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失，約占60%-70%第四十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日MLPA

技術簡介MLPAMultiplexligation-dependentprobeamplification鏈接依賴型多探針擴增技術最早由荷蘭人SchoutenJP(SchoutenJPetal,2002)在原有PCR技術上發(fā)展出來第四十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日MLPA

技術原理第四十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日MLPA方法檢測DMD

12345第四十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日5.成人型多囊腎是一種最常見的單基因遺傳性腎病，發(fā)病率約為1/1000其主要特征在雙腎形成進行性增長的多個液性囊腫，最終可引起腎衰竭具有遺傳異質(zhì)性，存在兩個主要的致病基因PKD1和PKD246第四十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日47ADPKD分子遺傳基礎GenePKD1PKD2PKD3?Chromosomallocus16p13.34q22-23ClonedYesYesPercentage~85%~15%Exons/Single-copyexons46/Ex35-4615/Ex1-15Mutationnumber343100HotmutationNoNo第四十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日PKD1基因結(jié)構(gòu)的復雜性第四十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日PKD基因分析:直接基因突變分析：適于散發(fā)病例和小家系病例。具有結(jié)果判讀的不確定性連鎖分析:

適于分析在已知致病基因編碼區(qū)未檢測到突變的較大家系，不適于散發(fā)病例和小家系病例49第四十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日PCR-測序分析在PKD1外顯子編碼序列上發(fā)現(xiàn)無義突變，使突變堿基所在密碼子由CGA變?yōu)榻K止密碼子TGA。第五十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日連鎖分析結(jié)果第五十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日新致病基因的研究方法和技術第五十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日家系連鎖分析來定位:

適于分析較大的遺傳病家系，不適于散發(fā)病例和小家系病例二代測序技術：適于散發(fā)病例和小家系病例研究對象不同，策略方法不同

連鎖分析與二代測序相結(jié)合加快新基因的發(fā)現(xiàn)第五十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日ATGGTCTCACTGCAACCGATGGTCTCACTGTAACCGMetValSerLeuGlnProMetValSerLeuStop定位克隆第五十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日

利用被定位的基因與在同一染色體上另一遺傳座位相連鎖的特點，將該基因定位在某一染色體或染色體某一區(qū)帶上。連鎖分析第五十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日DNASTRSNP常見遺傳標記第五十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日PCR-STR連鎖分析CACACAPrimer1Primer2CACACACACACACACACACACACACACACA第五十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第五十八頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日毛細管電泳分析PCR片段大小第五十九頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日分析D4S1534D4S2929D4S2460D4S423I-1114,124176,178200,202105,112II-1114,120153,159200,202107,109II-2114,124157,176202,204105,112II-3114,122157,178200,202102,105II-4114,124157,176202,204105,112II-5114,124157,176198,202107,109III-1114,124153,176200,202109,112III-2114,124176,176202,202109,112第六十頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日連鎖分析結(jié)果第六十一頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日均勻分布于23對染色體上的STRSNP芯片通過全基因組掃描來定位基因第六十二頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日外顯子組測序用二代測序技術尋找致病基因全基因組測序第六十三頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第六十四頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第六十五頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第六十六頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第六十七頁，共七十四頁，編輯于2023年，星期日第六十八頁，共七十四頁，編輯于