DNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析

DNA泳見(jiàn)問(wèn)分

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個(gè)收整，做業(yè)途DNA電泳常見(jiàn)問(wèn)凝膠電操作注意事1、瓊糖：不同廠家、不同批號(hào)的瓊脂糖，其雜質(zhì)含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強(qiáng)度，應(yīng)有選擇地使用。2、凝的制備：凝膠中所加緩沖液應(yīng)電泳槽中的相一致，溶化的凝膠應(yīng)及時(shí)倒入板中，避免倒入凝固結(jié)塊。倒入板中的凝膠應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡，以免影響電泳結(jié)果。3、電泳緩沖液：為保持電泳所需的子強(qiáng)度和應(yīng)經(jīng)更電緩沖。4、樣品加入量一情況下0.5cm寬梳可加0.5DNA量加量的多少依據(jù)加樣孔大小及中片段的數(shù)量和大小而定當(dāng)樣孔大時(shí)樣上樣量應(yīng)相應(yīng)加大,否則會(huì)造成條帶淺甚至辨認(rèn)不清;反則應(yīng)適當(dāng)減少加樣量但上樣過(guò)會(huì)成樣超，而致尾彌，于較的DNA此象明顯5、DNA樣中鹽濃度會(huì)影響的移率，平行對(duì)照樣品應(yīng)使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。6、遷率取決于瓊脂糖凝膠的濃度遷移分子的形狀及大小采用不同度的凝膠有可能分辯范圍廣泛的分子，制備瓊脂糖凝膠可根據(jù)分子的范圍來(lái)決定凝膠的濃度。小片段DNA的測(cè)應(yīng)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，以提高分辨率。選的實(shí)驗(yàn)材料要新鮮，處理時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)加入細(xì)裂緩液，胞須勻散以減DNA團(tuán)形。提的不溶解：不純，含雜質(zhì)較多；加溶解液太少使?jié)舛冗^(guò)大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。10.電檢時(shí)DNA成布：作不；染酸等11.分光光度分析的小于1.8；不純，含有蛋白等雜質(zhì)。在這種情況下，應(yīng)加入SDS至終濃度為，重復(fù)步驟～。12.酚/氯/異戊醇抽提后，其上液太黏不易吸?。汉邼舛鹊腄NA，加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量DNA電泳見(jiàn)問(wèn)題析之一1請(qǐng)問(wèn)制丙酰凝電膠，凝是TEMED還過(guò)硫銨膠時(shí)很如解？過(guò)硫酸銨提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速它倆的聚合。膠聚合時(shí)間長(zhǎng)可能是TEMED失了，過(guò)硫酸銨固體時(shí)間過(guò)久也失效的。一個(gè)讓PAGE膠快聚合的方法：不要先配AP（過(guò)硫酸銨）溶，因?yàn)锳P很易變質(zhì)。在保證TEMED和AP質(zhì)的情況下，每次配膠時(shí)，直接稱一定量的粉溶入液體狀態(tài)的PAGE中這樣可以保證AP的催化能力，而且可以多加一點(diǎn)。配25ml的PAGE膠加0.03克AP劑，最后加入25ulTEMED，20分左右就可以凝固（當(dāng)然這個(gè)時(shí)候拔梳子，會(huì)有少量未凝固的PAGE在里形成絲狀干擾，使加的樣品看起來(lái)不太漂亮，但一般不影響跑膠效果和條帶的形狀和位置）。2DNA泳怎是曲？1、配膠的緩沖液需要和電泳緩沖液不是同時(shí)配制.最好是同時(shí)配制.泳時(shí)緩沖液高過(guò)液面1－2mm3

個(gè)收整，做業(yè)途即可。2、電時(shí)壓過(guò),可以在電泳前15鐘用較低電壓3V/cm),等帶出孔后比較漂.然后再調(diào)電壓。3、上時(shí)量慢慢加,等樣品自然沉降再加電壓。3跑出DNA帶模？1、DNA降：免核酸酶污染。2、電緩液陳:電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)降低值升，緩沖能減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液。3、所電條件不合:電泳時(shí)電壓不應(yīng)過(guò)20V/cm，溫度＜℃巨大DNA鏈泳，溫度應(yīng)15；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。4、DNA上量多：減少凝膠中DNA上量。5、DNA樣鹽高：電泳前通過(guò)乙醇沉淀去除過(guò)多的鹽。6、有白染：電泳前酚抽提去除蛋白。7、DNA變：泳前勿加熱，用NaCl緩液稀釋。4有不則遷1、對(duì)cos位復(fù)性：電泳前于65℃加熱5分，然后在冰上冷卻分。2、電條不合適：電泳電壓不超過(guò)20V/cm；溫度30℃經(jīng)常更換電泳緩沖液。3、DNA變：20mMNaClBuffer稀，電泳前勿加熱。5跑出DNA條帶弱無(wú)？1、DNA的上樣不夠：增加DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高上樣量可適當(dāng)降低。2、DNA降：免DNA核酸酶污染。3、DNA走凝：縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度。4、對(duì)EB染的，用源不合??用短波長(zhǎng)254nm）的紫外光源。6跑出DNA帶缺不整怎回1、如是DNA帶出凝膠，可以縮短電泳時(shí)間或降低電壓或增強(qiáng)凝膠濃度。2、分大相近的DNA帶易分辨?加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度。3、DNA變：泳前請(qǐng)勿高溫加熱DNA，以20mMNaClBuffer稀。DNA鏈大，常規(guī)凝膠電不合?在脈沖凝膠電泳分析。7做電泳后電，目基是489BP的，果次切回后跑泳變500多，快到600？什？有時(shí)只靠電泳結(jié)果判斷是不準(zhǔn)確的，同樣的片段每次跑的遠(yuǎn)近會(huì)有不同。有經(jīng)驗(yàn)顯示目的片段是1300多果跑到1000的marker面去了來(lái)證實(shí)片段沒(méi)有問(wèn)題做的一個(gè)片段也是這樣490BP.理論上兩個(gè)條帶一樣，可是PCR結(jié)顯示就是大小不一致。然后回收以后的檢測(cè)結(jié)果又全部都一樣了，后來(lái)又拿去做了下一個(gè)測(cè)序，才知道根本沒(méi)有問(wèn)題。：為么marker條帶常模，法別體帶A：出現(xiàn)上述情況，可能有以下個(gè)原因：1.marker條出現(xiàn)了降解。請(qǐng)保在使用過(guò)程中避免核酸酶污染2.電泳沖液陳舊。電泳緩沖液多次使用后，離子濃度降低，上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果，建議經(jīng)常更換電泳沖液；4

個(gè)收整，做業(yè)途3.電條件不合適。電泳時(shí)電壓應(yīng)不超過(guò)20V/cm，度應(yīng)低于℃4.marker上量過(guò)多請(qǐng)根據(jù)說(shuō)明書選用合適上樣量；5.凝質(zhì)不好。建議使用質(zhì)量較好的瓊脂糖；此外，凝膠凝固不均勻也會(huì)導(dǎo)致條帶模糊。：為么marker條帶現(xiàn)不則條（啞狀）A：出現(xiàn)上述情況，多與以下幾原因有關(guān)電緩沖液陳舊。老化的電泳緩沖液離子濃度降低值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果，建議經(jīng)常更換電泳緩沖液電泳件不合適。電泳電壓應(yīng)不超過(guò)20V/cm電太可能會(huì)致條帶現(xiàn)規(guī)現(xiàn)象外膠量以凝冷時(shí)固均也導(dǎo)致該現(xiàn)象出現(xiàn)。為么marker條帶非弱者本有帶A：出現(xiàn)上述情況可能是1.marker上樣量較低，可適當(dāng)增加上樣量2.凝膠質(zhì)量較差或凝膠固不均勻也會(huì)導(dǎo)致電泳條帶弱或根本沒(méi)有條帶3.電時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致marker條跑出凝膠，可縮短電時(shí)間，降低電壓，增加凝膠濃度。：為么marker缺帶？A：對(duì)于含有較小片段的marker，果出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象，可能是因?yàn)椋?.小帶跑出凝膠或分子量大小非常相近的條帶不易辨認(rèn)所致，可適當(dāng)縮短電泳時(shí)間，降低電，同時(shí)增加凝膠濃度2.凝中EB含量過(guò)低，導(dǎo)致大片段結(jié)合量太或沒(méi)有，在紫外光下亮度太低，可適當(dāng)增加EB用。問(wèn)題DNA帶模糊

適

原因DNA解電泳緩沖液陳舊所用電泳條件不合DNA上量過(guò)多DNA樣鹽過(guò)高有蛋白污染DNA變

解決辦法避免核酸酶污染電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm溫度＜℃巨大DNA鏈泳，溫度應(yīng)＜15℃；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力減少凝膠中DNA樣量電泳前通過(guò)乙醇沉淀去除過(guò)多的鹽電泳前酚抽提去除蛋白電泳前勿加熱，用20mMNaCl緩液稀釋DNA不規(guī)則DNA帶移帶弱或無(wú)DNA帶

對(duì)于λ/Hindcos位復(fù)性電泳條件不合適DNA變DNA的樣量不夠DNA降DNA走凝膠對(duì)于染色的

電泳前于65℃加熱5分，然后在冰上冷卻5分電泳電壓不超過(guò)20V/cm溫度30℃經(jīng)更電泳緩沖液以20mMNaClBuffer稀，電泳前勿加熱增加的樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當(dāng)降低避免的酸酶污染縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度應(yīng)用短波長(zhǎng)（254nm）的紫外光源5

個(gè)收整，做業(yè)途DNA帶缺失

，用光源不合小DNA帶走出凝膠分子大小相近的DNA帶易分辨DNA變性

縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增強(qiáng)凝膠濃度增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確的凝膠濃度電泳前請(qǐng)勿高溫加熱DNA鏈，以20mMNaClBuffer稀釋DNADNA鏈大

常規(guī)凝膠電泳不合適

在脈沖凝膠電泳上分析問(wèn)題DNAMarker降解DNAMarker無(wú)法正確分離條帶黯淡條帶模糊或彌散條帶缺失

可能原因核酸酶污染保存不當(dāng)瓊脂糖質(zhì)量差電泳緩沖液多次使用后失效核酸濃度過(guò)低核酸降解DNA條帶被示蹤染料掩蓋電泳緩沖液多次使用后失效核酸部分降解核酸樣品純度差，含有DNA結(jié)合蛋白或高濃度的鹽份電壓過(guò)低，電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或拍照前放置過(guò)久，DNA條帶彌散DNA條帶分子量過(guò)大分子量接近的DNA條帶沒(méi)有分開(kāi)電泳緩沖液使用不當(dāng)電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或電壓過(guò)高，DNA走出凝膠電極插反，DNA走出凝膠6

解決方法每次吸取時(shí)更換滅菌槍頭將泳緩沖液帶入管中；用后密閉4°存4°或-20°C保存，避免多次反復(fù)凍融；不可加熱使用質(zhì)量可靠的瓊脂糖制膠更換緩沖液增加上樣量使用不含核酸酶的試劑和耗材制樣品提高上樣量免使用與目的片遷移率相同的示蹤染料更換緩沖液使用不含核酸酶的試劑和耗材制樣品酚/仿抽提乙醇沉淀去除蛋白、鹽份等雜質(zhì)根據(jù)凝膠大小和電泳緩沖液類型用適當(dāng)?shù)碾妷哼M(jìn)行電泳電泳結(jié)束后及時(shí)觀察、拍照使用脈沖凝膠電泳選擇適當(dāng)?shù)哪z濃度進(jìn)行電泳SD和TBE緩沖液適于分析較小分子量的DNA片段片段分子不完全分離；TAE沖液不適于分離很小的DNA片段縮短電泳時(shí)間，調(diào)整電壓正確連接電極方向

個(gè)收整，做業(yè)途條帶大小不正確帶型異常

核酸降解或形成聚合物λDNA酶切Marker的cos位點(diǎn)復(fù)性相同分子量的DNA片段由于結(jié)構(gòu)或序列的差異而有不同的遷率梳子變形，點(diǎn)樣孔不在同一水平線上不同樣本的上樣條件不同上樣量過(guò)大或過(guò)小核酸樣品純度差，含有DNA結(jié)合蛋白或高濃度的鹽份電泳緩沖液未完全浸沒(méi)凝膠電壓過(guò)高或電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)致使凝膠過(guò)熱和變凝膠中加入EB造成染色不均凝膠中有氣泡或污染物點(diǎn)樣孔質(zhì)量差

加熱處理或重新制備樣品電泳前C加熱分鐘，冰上冷卻5分鐘以后再上樣判斷DNA