柱層析原理詳解課件

柱層析原理詳解課件第一頁，共59頁。AIntroductiontoChromatography

2006.07ColumnchromatographyPreTLC第二頁，共59頁。ColumnChromatography

第三頁，共59頁。第四頁，共59頁。柱層

原理吸附劑相互作用影響分離的參數(shù)裝柱上樣洗脫技術(shù)柱的監(jiān)控第五頁，共59頁。有機化學(xué)家能用的最現(xiàn)代化和尖端的方法全部包括某種類型的層析法.

層析法的定義是,通過在兩相之間的分配,使一個由兩種或多種不同化合物(有時是離子)組成的混合物得到分離,這兩相中一相是固定的,另一相則是移動的.

根據(jù)所包括的兩個相的性質(zhì),可有各種可能形式的層析法;供普通使用的有固-液(柱,薄層和紙),液-液和氣-液(蒸氣相)層析法.所有層析法所根據(jù)的工作原理都是憑借于欲待分離的幾種物質(zhì)在將它們進行分配的兩相之間的溶解度(或吸附度)上的差別.原理第六頁，共59頁。吸附劑

柱層析法是以吸附度和溶解度這兩者為根據(jù)的一種技術(shù),它是一種固-液相間進行分配的技術(shù).其中的固體幾乎可以是任何物料,只要不溶解于附著的液相中即行.但最常用的一些固體是硅膠(SiO2xH2O)也叫做硅酸,和氧化鋁(Al2O3xH2O).

這些化合物均用其粉狀或磨細的形式(通常為200至400目)層析法中所用的極大多數(shù)氧化鋁系從粗的鋁礦石(Al2O3xH2O+Fe2O3)制得.將鋁土礦石溶于熱氫氧化鈉溶液中,過濾除去不溶的氧化鐵;礦石中的氧化鋁則成為可溶性的兩性氫氧化物Al(OH)4-.這個氫氧化物用CO2(它能降低PH)使沉淀成為Al(OH)3,在加熱時,此Al(OH)3失水成為純的Al2O3.

第七頁，共59頁。吸附劑按此方法制得的氧化鋁稱為堿性氧化鋁.因為它仍舊含一些氫氧化物.堿性氧化鋁不能用于對堿敏感的化合物的層析分離.因此,要用酸加以洗滌以便將堿中和,這樣便得到酸性氧化鋁.這種物料仍然不能令人滿意,除非經(jīng)過足夠的水洗以除去所有的酸,才能獲得最適用于柱層析的物料,稱為中性氧化鋁.如果化合物是酸敏感的,必須使用堿性或中性氧化鋁,必須仔細的弄清你在層析法中所用的氧化鋁屬於哪一類型.硅膠除了以適用于層析法的形式供應(yīng)外別無任何其他類型.第八頁，共59頁。相互作用若將粉末狀或磨細的氧化鋁(或硅膠)加入至含有一種有機化合物的溶液中時,一部分有機物將會吸附或黏在氧化鋁細粒上,使有機分子和氧化鋁結(jié)合的力有好幾種.這些力按其種類不同,強度不一.非極性化合物只用范德華(Vanderwaals)力與氧化鋁結(jié)合.這種力較弱,故非極性化合物不能結(jié)合得很牢除非它們的分子量非常大.極性有機化合物所用的相互作用力則較為重要,此中所用之力或為偶極-偶極相互作用力,或為某種直接的相互作用力(配位作用,氫鍵,或鹽的形成等).第九頁，共59頁。相互作用這些相互作用的強度變化次序大致是:鹽的形成>配位作用>氫鍵>偶極-偶極相互作用力>范德華力第十頁，共59頁。相互作用對於溶解度來說,也有類似的法則.極性溶劑對極性化合物的溶解比非極性溶劑更為有效;非極性化合物則最易被非極性溶劑所溶解.因此任何一個給定溶劑洗下吸附在氧化鋁或硅膠上的化合物的能力大小幾乎直接決定于該溶劑的相對極性.對於每一被吸附著的物料來說,可以想象它們在吸附劑和溶劑之間都有一種分配平衡,即不斷地從溶液中吸附分子又不斷地向溶液中解吸分子.

達到平衡時最終被吸附在顆粒上的分子的平均數(shù)既取決于所涉及的特殊分子又取決于吸附劑必須與之競爭的溶劑的溶解效力.第十一頁，共59頁。影響分離的參數(shù)層析法是分離混合物的常用方法,許多可以改變的因素使層析法成為一種多方面適用的方法.這些因素包括:1.選定的吸附劑2.選定的溶劑極性3.相對于需待分離的物料量的柱子尺寸(長度和直徑)4.洗脫(或流動)的速率第十二頁，共59頁。A.吸附劑吸附劑的選擇通常要根據(jù)需待分離的化合物的類型而定.主要有:

纖維素,淀粉和糖類:

用于對酸堿相互作用非常敏感的多官能團的動,植物性化合物(天然產(chǎn)物)

硅酸鎂:

分離乙?；奶穷?甾體化合物和香精油.

硅膠和合成硅酸鎂載體(Florisil):

對大多數(shù)化合物來說相對地比較溫和,故可廣泛適用于種種官能團—烴,醇,酮,酯,羧酸,偶氮化合物,胺.

第十三頁，共59頁。吸附劑

氧化鋁:分為酸性(PH=4),中性,堿性(PH=10).

這種吸附劑特別適用于分離象羧酸和氨基酸之類的酸性物質(zhì).堿性氧化鋁的PH約為10,故適用于分離胺.

中性氧化鋁可用于分離各種非酸性和非堿性物質(zhì).第十四頁，共59頁。吸附劑*應(yīng)該特別注意的是,這個次序是近似的,可變的.如氧化鋁和硅膠的強度或分離能力在很大程度上取決于其中所存在的水.水能非常緊密地與這兩種吸附劑結(jié)合,占去顆粒上的一些部位,這些部位本來是可供平衡用的.因此如果將吸附劑里面加進水,我們便稱為失活.無水氧化鋁或硅膠則是高度活化的,這種高活性是吸附劑需要避免的,因為這種高活性會使得吸附劑和待分離的化合物發(fā)生某些形式的破壞作用和分解作用,往往能引起某些類型的溶質(zhì)化合物發(fā)生分子重排反應(yīng).第十五頁，共59頁。B溶劑各類溶劑的極性次序如下表:

第十六頁，共59頁。溶劑在層析分離過程中,若擬改變?nèi)軇┑臉O性,要采取一些預(yù)防措施.務(wù)須避免迅速從一種溶劑換成另一種溶劑(尤其是當(dāng)使用硅膠或氧化鋁時).通常,應(yīng)將新溶劑以小百分比慢慢混入正在使用的溶劑中.如不這樣做,柱內(nèi)填重料往往會出現(xiàn)縫隙.縫隙之所以發(fā)生是由於氧化鋁或硅膠與溶劑混合時放熱所致.溶劑將吸附劑溶劑化,從而形成一種弱鍵而放出熱量.

溶劑+氧化鋁(氧化鋁?溶劑)+熱往往能在局部地方生成足能使溶劑蒸發(fā)的熱量.蒸氣的產(chǎn)生造成了氣泡,氣泡又把柱內(nèi)填充料擠開,這就是所謂的縫隙.第十七頁，共59頁。溶劑使用氧化鋁或硅膠時,要避免使用某些溶劑,特別是酸性的,堿性的和高活性形式的溶劑.舉例來說,丙酮會與任何一個這樣的吸附劑通過醇醛縮合作用二聚成乙酰丙酮.當(dāng)用乙酸乙酯或醇類作為洗脫液時,會使酯類的混合物發(fā)生酯交換作用.最后,更活潑的溶劑(吡啶,甲醇,水和乙酸)會溶解和洗脫一部分吸附劑本身.第十八頁，共59頁。溶劑第十九頁，共59頁。溶劑一般來說,各類化合物被洗脫時,非極性化合物最先洗脫,極性化合物最后洗脫.可是,分子量也是一個決定洗脫次序的因素.高分子量的非極性化合物將比低分子量的非極性化合物洗脫得慢,甚至可能被某些極性化合物所超過.具有下列極性基團的化合物,其吸附能力按下列排列次序遞增:第二十頁，共59頁。C柱的尺寸和吸附劑量為了能使一定數(shù)量的樣品達到良好分離,還應(yīng)正確地選定柱尺寸和吸附劑的量一條經(jīng)驗規(guī)律是,吸附劑的量應(yīng)是需待分離的混合物重量的25至30倍.

另外,所用柱子的高度和直徑之比應(yīng)大約為8:1.但要注意的一點是,柱的尺寸和長度及需用吸附劑的量還決定于分離的困難程度.不易分離的化合物可能需要更長的柱子和更多的用量.第二十一頁，共59頁。柱的尺寸和吸附劑量某些典型樣品量適用的柱尺寸和吸附劑數(shù)量樣品量吸附劑量柱直徑柱高

0.01g0.3g3.5mm30mm0.1g3g7.5mm60mm1.00g30g16.0mm130mm10.00g300.0g35.0mm280mm第二十二頁，共59頁。D流速溶劑流經(jīng)柱子的速率對於決定一個分離能進行得多好也起著作用.一般來說,需待分離的化合物在柱上逗留愈久,其在固定相和移動相之間的平衡愈廣泛.結(jié)果可以使較為相似的化合物得到分離.然而如果流速過慢,則混合物中各個物質(zhì)到了溶劑中后其在溶劑中的擴散速率可能變得大於這些物質(zhì)沿柱下行速率.在這種情況下譜帶變寬,反而使分離效果變差.事實上,在溶劑極性相同的情況下,溶劑的流速一般而言（HPLC，MPLC除外），流速均以越快越好，因為一般而言流動相流速與板高成反比，而板高越小越好，所以流動相流速越快越好。所以快速第二十三頁，共59頁。流速（加壓）柱層析的效果比一般重力柱層析好。第二十四頁，共59頁。裝柱柱層析法中最關(guān)鍵性的操作是裝柱.柱子在用吸附劑填充時必須裝得非常均勻,如果裝得不整齊,出現(xiàn)氣泡,縫隙等會明顯影響分離效率.主要存在兩種情況:一:譜帶的最前面的邊緣或稱前沿不水平,如果兩條譜帶緊靠在一起而又無水平的譜帶前沿,那么要想收集每一條譜帶而把另外一條譜帶完全排除在外是不可能的!

造成這個問題的因素有兩個:1.吸附劑填充料的頂面不呈水平.2.柱子未被夾持在兩個平面中(即前-后,左-右兩個平面)完全垂直的位置.

第二十五頁，共59頁。裝柱二:譜帶前沿的一部分從譜帶的主體部分中間向前伸出,此時發(fā)生的現(xiàn)象稱為流動或稱溝流.

造成這種現(xiàn)象的原因主要是吸附劑表面不平整或在填料中有任何不平整性或氣泡.第二十六頁，共59頁。

第二十七頁，共59頁。

第二十八頁，共59頁。裝柱A濕法(漿液法)

即吸附劑以漿液狀態(tài)被裝入管內(nèi).漿液是一種溶劑和一種不溶解的固體的混合物.操作方法是將固體吸附劑慢慢加入盛有大量溶劑的容器中.注意要嚴格遵守這種加料次序(加吸附劑至溶劑),

因為吸附劑在加入到溶劑中時會因溶劑化效應(yīng)而放熱.若向吸附劑內(nèi)加溶劑,由於發(fā)熱會使溶劑幾乎與加入速率一樣快地氣化逸出,使最終的混合物不均勻或結(jié)塊.因此通常的做法是將吸附劑加入溶劑中,邊加邊旋搖,使其形成一種稠厚但能流動的漿液.漿液應(yīng)不斷旋搖直至已呈均勻狀態(tài)且相對地不再含有空氣泡為宜.第二十九頁，共59頁。裝柱

裝柱時,先向柱內(nèi)充入溶劑至約半滿,然后開啟活塞讓溶劑慢慢流下,借助旋搖動作使?jié){液混合,然后慢慢傾入正在流出溶劑的柱子的頂部.同時要不斷輕輕地敲擊柱壁,促進均勻沉降和混合,避免空氣泡的形成.同時在所有物料沉降好之前要持續(xù)輕敲柱壁,這樣可以使柱頂形成一個非常合格的水平面.

另外如果漿液有時因變得太厚而無法傾倒,可將收集在燒杯中的溶劑重新加至漿液內(nèi).然后將收集到的溶劑在柱內(nèi)反復(fù)循環(huán)幾次以保證沉降完全及柱子的緊實.第三十頁，共59頁。B

干法方法一:用溶劑將柱子充滿并讓它緩緩流出.在按上述方法不停地輕敲柱子的同時,每次少量地把干的吸附劑加入柱中.此法也可得到裝得很均勻的柱.同上法一樣,每次使用前應(yīng)將溶劑反復(fù)循環(huán)通過幾次.方法二:先將干的吸附劑裝入柱中,硅膠面壓實頂部水平后將溶劑緩慢滲瀝穿過柱子,直至柱子全被浸潤.但此法容易造成柱子不勻,空氣泡和縫隙,尤其是使用在溶劑化過程中有高度放熱的溶劑時,這些問題尤為突出.第三十一頁，共59頁。上樣分為以下幾個步驟:將固體樣品溶于極少量適宜的極性溶劑中,溶劑的極性應(yīng)比樣品的極性小一些,否則樣品不易被吸附.溶劑對樣品的溶解度也不宜過大.

通過排液,使溶劑的水平面剛好低于吸附劑的頂部.

將待分離的溶液用移液管(或長滴管)加入柱頂.注意要接觸柱的內(nèi)壁慢慢沿柱壁散布放樣使其慢慢下降.從而使整個吸附劑表面都被其均勻地蓋住.同時要注意盡量使移液管貼近吸附劑表面.第三十二頁，共59頁。上樣D讓這一薄層液體進入柱內(nèi),直至柱頂表面恰好開始瀝干為止.E:小心用移液管加入一薄層層析分離溶劑,小心不要攪動表面,讓這一薄層溶劑排入柱中直至這段柱正好瀝干,目的是洗滌柱壁上附著的樣品.如樣品有色,則可從新鮮溶劑層上有沒有這種樣品的顏色來判斷樣品有沒有被完全吸附.F:向柱頂加入石英砂并注入溶劑.第三十三頁，共59頁。上樣*在開始洗脫之前讓樣品在柱中停留一段短時間往往可以得到較好的分離,這樣做可以建立起一個真正的平衡.然而,必須指出,在一個經(jīng)過長時期放置的柱中,吸附劑往往會變得緊密甚至溶脹,而流速也可能變得令人討厭地慢.如果柱子放置時間過長,也會出現(xiàn)樣品擴散而使譜帶變寬的問題.第三十四頁，共59頁。洗脫

洗脫溶劑的選擇是柱色譜分離的重要環(huán)節(jié).通常先用非極性溶劑洗脫出極性小的部分,再慢慢加大極性進行洗脫.

常用溶劑和混合溶劑的洗脫力按遞增次序排列如下:

己烷和石油醚<環(huán)己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷-乙醚(80:20)<二氯甲烷-乙醚(60:40)<環(huán)己烷-乙酸乙酯(20:80)<乙醚<乙醚-甲醇(99:1)<乙酸乙酯<四氫呋喃<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸<甲酸第三十五頁，共59頁。柱的監(jiān)控一:通過薄層層析板進行監(jiān)控二:通過加入無機熒光體.當(dāng)用紫外光照射時,經(jīng)過此處理的吸附劑會發(fā)熒光.但也有一些溶質(zhì)有使這種熒光體指示劑的熒光淬滅的能力,因此在有這些溶質(zhì)存在的區(qū)域,吸附劑將不發(fā)熒光,從而可以看到一條暗譜帶.第三十六頁，共59頁。拖尾會干擾第二個組份的分離,避免的一個辦法是在洗脫時不斷地提高溶劑的極性.用這種方法時,由於在峰的尾部處極性正在增大,化合物就會比其前緣處移動得快,從而使尾部緊縮,形成一個更近乎理想的譜帶拖尾第三十七頁，共59頁。幾點注意1.層析樣品的RF值（Retenitionfraction）是指樣品中心區(qū)與流動相前端距起始點的距離的比值

第三十八頁，共59頁。

幾點注意

2.任何化合物若以TLC檢驗其純度，其所顯示的Rf值超過0.7或低于0.1時，均無法確認其是否為單一點，因為在此種Rf值時，許多Rf值較接近的點均有可能重合。所以我們選擇觀察物最適合的Rf值為0.3－0.5。

3.過柱子時所選用的溶劑系統(tǒng)應(yīng)配合選用硅膠的用量及樣品的量來選擇其極性組合，一般而言欲分離的主樣品Rf值以0.15－0.25為宜。第三十九頁，共59頁。幾點注意4.一般最常用的溶劑系統(tǒng)依其極性大小依次為正己烷（或石油醚）<乙酸乙酯<甲醇的組合為最通用，其他如乙醚也常為中極性的溶劑，對含氯有機溶劑如DCM，CHCl3常有特殊的效果，而笨對含芳香性的化合物也會有出人意料的好效果。

5.過柱子所用的溶劑在配好后，應(yīng)以TLC再作檢查試一次，以確定是否為恰當(dāng)?shù)娜軇w系。

第四十頁，共59頁。幾點注意6.在填裝層析柱時若不慎有氣泡（如溶劑部分流干引起）可補滿溶劑后以木棒輕敲管壁，使氣泡浮出。因為氣泡中沒有填充物，分離物流經(jīng)此處時移動速度會較其他處為快，而造成此處分離物與其他無氣泡處的分離無排列次序混亂，影響分離效果。7.在過柱子時所收集的餾分體積通常為硅膠克數(shù)的1/4以下。實際情況可引用下列公式求出粗略值，如欲分離成分A與B，而A的Rf值為0.3，B的Rf值為0.2，則最合適的分離體積為：設(shè)硅膠量為50gV＝2xWx(RfA-RfB)=2x50x(0.3-0.2)=10ml第四十一頁，共59頁。PTLC第四十二頁，共59頁。

分離時間短，效率高操作簡便分離樣品少特點第四十三頁，共59頁。原理各組分對吸附劑吸附能力不同吸附能力弱（即極性較弱的）隨流動相移動吸附能力強（即極性較強的）隨流動相移動慢第四十四頁，共59頁。PTLC板

吸附劑最常用的吸附劑是硅膠硅膠是無定型多孔物質(zhì)，略具酸性適用于中性或酸性物質(zhì)的分離。制備和活化負載量1.0mm，<5mg/cm2e.g.20×20cm,10~100mg第四十五頁，共59頁。確定展開劑上板展板顯色刮板與洗脫PTLC過程第四十六頁，共59頁。確定展開劑

溶解樣品時應(yīng)選用溶解度大，沸點低、易揮發(fā)的溶劑溶劑量控制在1.5~2ml/塊板

產(chǎn)物的Rf值調(diào)至0.4~0.6P-TLC可直接用TLC條件第四十七頁，共59頁。上板

準備硅膠板自制的一次性滴管上板次數(shù)≤4次左右約1cm處不上樣寫上化合物編號第四十八頁，共59頁。第四十九頁，共59頁。

用滴管吸取樣品溶劑，緩慢并且勻速地在板上劃一條直線如果點樣太寬，可用大極性溶劑將其展開至2~4cm，再吹干不要污染板線條盡可能細如果可能，點樣