基因操作中大分子的分離和分析

基因操作中大分子的分離和分析第1頁/共95頁第一節(jié)DNA的分離、檢測(cè)和純化

一、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的分離和純化二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳三、聚丙烯酰胺凝膠電泳四、脈沖場(chǎng)凝膠電泳五、DNA片段的純化第2頁/共95頁天然DNA來源:

①染色體DNA。

②病毒和噬菌體DNA。

③質(zhì)粒DNA。

④線粒體和葉綠體DNA。第3頁/共95頁一、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的分離和純化

分離質(zhì)粒DNA的方法眾多，其依據(jù)是利用分子大小不同、堿基組成的差異以及質(zhì)粒DNA的超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)來進(jìn)行分離。目前常用的有堿裂解法、煮沸法、去污劑(如Triton或SDS)裂解法、羧基磷灰石柱層析法、質(zhì)粒DNA釋放法、酸酚法等。第4頁/共95頁1堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒DNA原理

◆堿裂解法由Birnboim和Doly設(shè)計(jì)并于1979年發(fā)表，基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的?！粼趐H高達(dá)12.5的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。第5頁/共95頁◆當(dāng)以pH4.6的KAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?！敉ㄟ^離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。第6頁/共95頁大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取步驟第7頁/共95頁pET28c(+)電泳結(jié)果第8頁/共95頁堿抽提法所用試劑的生化作用

提取過程中所用的材料有LB培養(yǎng)基、葡萄糖/Tris/EDTA溶液(5Ommol/L葡萄糖；25mmol/LTris?HCl；pH8.0，lOmmol/LEDTA)、TE緩沖液、3mol/L乙酸鉀溶液、NaOH-SDS溶液、溶菌酶液、異丙醇、100%乙醇和70%乙醇等。

第9頁/共95頁①溶菌酶:溶菌酶是糖苷水解酶，水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1，4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。

葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。

EDTA:EDTA螯合Mg2+和Ca2+等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用,同時(shí)有利于溶菌酶的作用。

第10頁/共95頁②NaOH-SDS液:NaOH濃度為0.2mol/L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。SDS是離子型表面活性劑，它可以溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜、解聚細(xì)胞中的核蛋白，還能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-S03-…R+一蛋白質(zhì)的復(fù)合物,使蛋白質(zhì)變性沉淀下來。第11頁/共95頁③KAc:

pH4.8的KAc溶液是為了把pHl2.6的抽提液調(diào)節(jié)至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。高鹽3mol/LKAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物的凝聚而沉淀。染色體DNA因?yàn)橹泻土撕怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合，鉀鹽與RNA、SDS-蛋白復(fù)合物作用后，形成鉀鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。

第12頁/共95頁④無水乙醇:沉淀DNA，它的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比例和水相混溶，且乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全。DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。

第13頁/共95頁⑤酚-氯仿:酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。第14頁/共95頁⑥異戊醇:異戊醇能降低分子表面張力，能減少抽提過程中泡沫的產(chǎn)生。同時(shí)異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

第15頁/共95頁2023/3/26162通過試劑盒分離純化大腸桿菌質(zhì)粒DNA

第16頁/共95頁二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳1、凝膠電泳的基本原理一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。就是說，電場(chǎng)強(qiáng)度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度越快，反之則較慢。電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳遷移率。第17頁/共95頁2、影響電泳遷移速率的因素：1）分子篩效應(yīng)DNA分子在凝膠介質(zhì)中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖一磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。

第18頁/共95頁2）相對(duì)分子質(zhì)量具有不同的相對(duì)分子質(zhì)量的DNA片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。DNA樣品與已知相對(duì)分子質(zhì)量大小的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行電泳對(duì)照，觀察其遷移距離，就可獲知該樣品的相對(duì)分子質(zhì)量大小。凝膠電泳不僅可以分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的DNA，也可以鑒別相對(duì)分子質(zhì)量相同但構(gòu)型不同的DNA分子。第19頁/共95頁3）構(gòu)型在抽提質(zhì)粒DNA過程中，由于各種因素的影響，使超螺旋(SC)的共價(jià)閉合環(huán)狀(CCC)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒DNA的一條鏈斷裂，變成開環(huán)狀(OC)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就轉(zhuǎn)變?yōu)榫€狀(L)分子。這3種構(gòu)型的分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋型分子遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的為開環(huán)狀分子。當(dāng)提取到的質(zhì)粒DNA樣品中還有染色體DNA或RNA時(shí)，在凝膠電泳上也可以分別觀察到電泳區(qū)帶，由此可分析樣品的純度。

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第21頁/共95頁第22頁/共95頁3、DNA的瓊脂糖凝膠電泳1）DNA的顯示原理：制備瓊脂糖凝膠時(shí)加入溴化乙錠指示劑，溴化乙錠(EB)在紫外光照射下能發(fā)射桔紅色的熒光。當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物，使DNA發(fā)射的熒光增強(qiáng)幾十倍。熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品作瓊脂糖凝膠電泳對(duì)照，就可比較出待測(cè)樣品的濃度。若用薄層分析掃描儀檢測(cè)，只需要5～lOngDNA，就可以從照片上比較鑒別。如用肉眼觀察，可檢測(cè)到0.01～0.1μg的DNA。第23頁/共95頁2）影響電泳遷移的主要因素：◆DNA的大小◆DNA的構(gòu)象◆瓊脂糖濃度◆緩沖液：乙酸鹽緩沖液(TAE)、硼酸鹽緩沖液(TBE)、磷酸鹽緩沖液(TPE)。第24頁/共95頁不同構(gòu)像質(zhì)粒第25頁/共95頁瓊脂糖含（%）DNA片段的有效分離范圍(kb)0.35-600.51-300.61-200.70.8-121.00.5-101.20.4-61.50.2-42.00.1-3分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖凝膠濃度第26頁/共95頁第27頁/共95頁3）瓊脂糖凝膠電泳的操作過程A、緩沖液制備B、EB母液配制：10mg/ml，在4℃下保存C、將點(diǎn)樣梳洗凈干燥放入膠板中D、瓊脂糖膠板的制備：稱量加入三角瓶一定的瓊脂糖粉末，按所需凝膠濃度加入適量體積的緩沖液，將三角瓶塞口，微波爐中融化。融化好后冷卻到60℃左右，加入EB溶液，至最終濃度為0.5ug/ml。搖勻倒入放置好的點(diǎn)樣梳的膠板中，排走氣泡。室溫放置30-45min。第28頁/共95頁3）瓊脂糖凝膠電泳的操作過程E、加樣和電泳：將膠板放入電泳槽，注入緩沖液，使液面高于膠面1-2mm，排出加樣孔內(nèi)的氣泡，用微量移液槍加入DNA樣品。接通電源，調(diào)好電壓和電泳時(shí)間?？筛鶕?jù)溴酚蘭的位置結(jié)束電泳，關(guān)閉電源。F、取出凝膠，置于紫外投射儀上，調(diào)好相機(jī)焦距拍照第29頁/共95頁3）瓊脂糖凝膠電泳的操作過程第30頁/共95頁第31頁/共95頁紫外線光源靈敏度:302nm>254nm>366nm第32頁/共95頁第33頁/共95頁三、聚丙烯酰胺凝膠電泳特點(diǎn)：分辨率高適于寡聚核苷酸及DNA序列分析，DNA<500bp載樣量大回收DNA純度高第34頁/共95頁第35頁/共95頁四、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-fieldgelelectrophoresisPFGE)與常規(guī)的直流單向電場(chǎng)凝膠電泳不同，這項(xiàng)技術(shù)采用定時(shí)改變電場(chǎng)方向的交變電源，每次電流方向改變后持續(xù)1秒到5分鐘左右，然后再改變電流方向，反復(fù)循環(huán)，所以稱之為脈沖式交變電場(chǎng)。+++-----2第36頁/共95頁五、DNA片段的純化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求不同，有時(shí)需要高純度的DNA，對(duì)提取的DNA樣品須進(jìn)一步純化并除去溴化乙錠(EB)。常用的DNA純化方法有：低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳法、透析袋電洗脫法、氯化銫-溴化乙錠連續(xù)梯度離心法、離子交換層析法、“基因純”試劑純化等。第37頁/共95頁透析袋電洗脫法

適用于小劑量DNA純化和酶切DNA片段回收。DNA樣品在瓊脂糖凝膠電泳分帶。切取含待純化DNA帶的瓊脂糖凝膠塊，裝入透析袋，進(jìn)行電泳1-2h后，再反向電泳1-2min。吸取透析袋中的洗脫液于離心管中離心。轉(zhuǎn)移上清液到另一離心管中，加入2倍體積無水乙醇混勻，于-20℃放置過夜沉淀后，離心后上清液，最后把沉淀物溶于TE緩沖液中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第38頁/共95頁第39頁/共95頁

通過凝膠電泳回收的DNA樣品和氯化銫-溴化乙錠連續(xù)梯度離心制備的DNA樣品，因檢測(cè)需要而含有溴化乙錠(EB)，會(huì)影響限制性核酸內(nèi)切酶的切割，因此有必要去掉插入到DNA中的EB，常采用的方法有：正丁醇(或異戊醇)抽提或Dowex樹脂層析法等。第40頁/共95頁2023/3/2641韓國(guó)MEGAquick-spin?PCR產(chǎn)物與膠回收試劑盒第41頁/共95頁DNA的濃縮

當(dāng)提取的DNA溶液的濃度達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求時(shí)，必須進(jìn)行DNA溶液的濃縮。實(shí)驗(yàn)室常用的方法有：

乙醇沉淀法、正丁醇抽提法和聚乙二醇濃縮法等。

第42頁/共95頁（四）DNA的定量和純度測(cè)定

DNA樣品的濃度的測(cè)定，一般采用紫外光譜分析、EB熒光分析、水平式瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法和脈沖電泳法等。

第43頁/共95頁紫外光譜分析法

紫外光譜分析法的原理基于DNA(或RNA)分子在260nmm處有特異的紫外吸收峰且吸收強(qiáng)度與系統(tǒng)中DNA或RNA的濃度成正比。分子形狀、雙鏈與單鏈之間的轉(zhuǎn)換也會(huì)導(dǎo)致吸收水平的改變，但是這種偏差可以用特定的公式來校正。該法的特點(diǎn)是準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，但所需儀器較昂貴。第44頁/共95頁衡量所提取DNA的純度可用OD260與OD280的比值,OD260/OD280對(duì)DNA而言其值大約為1.8。當(dāng)OD260/OD280大于1.8則可能有RNA污染。當(dāng)OD260/OD280小于1.8時(shí)則有蛋白質(zhì)污染。雙鏈DNA的OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為50μg/mL。單鏈DNA的OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為40μg/mL。寡核酸的OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為20-40μg/mL。第45頁/共95頁EB熒光分析法

EB熒光染料能插入DNA或RNA的堿基對(duì)平面之間并結(jié)合在上面，在紫外光的激發(fā)下產(chǎn)生桔黃色熒光。由于結(jié)合于DNA分子之上的EB的量與DNA分子長(zhǎng)度和數(shù)量成正比，則熒光強(qiáng)度可以表示DNA量的多少。第46頁/共95頁將標(biāo)準(zhǔn)DNA溶液按濃度由低到高分別與同樣體積的EB溶液混勻在一塊黑色的點(diǎn)樣板上形成一個(gè)濃度梯度，然后將待測(cè)DNA也與同樣體積的溴化乙錠混勻，最后將待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在紫外燈下發(fā)出的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較，就能測(cè)出該樣品總DNA濃度。EB是嫌疑性的致突變物質(zhì)。第47頁/共95頁第二節(jié)RNA的分離、檢測(cè)和純化細(xì)胞中的核酸：DNA和RNA。RNA：rRNA、tRNA、mRNA。一個(gè)典型哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含10-5μgRNA。

－80%～85%rRNA(28S、18S、5SrRNA)。

－15%～20%低分子量RNA(如tRNA、核內(nèi)小分子RNA等）。

－1%～5%mRNA，一般按2%計(jì)算。第48頁/共95頁第49頁/共95頁實(shí)驗(yàn)成敗關(guān)鍵：創(chuàng)造一個(gè)無RNase的環(huán)境去除外源性RNase的污染：DEPC(焦碳酸二乙脂)抑制內(nèi)源性RNase的活性RＮase阻抑蛋白（RＮasin，非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑）氧銅核糖核苷復(fù)合物硅藻土第50頁/共95頁RNA的抽提與純化總RNA的制備真核生物mRNA的純化從總RNA中，用寡聚(dT)親和層析柱分離mRNA?？蓱?yīng)用PromegaPolyATtractmRNA分離系統(tǒng)分離多聚(A)mRNA。將用生物素標(biāo)記的寡聚(dT)引物與細(xì)胞總RNA共溫育，加入與微磁球相連的抗生物素蛋白，用磁場(chǎng)吸附通過寡聚(dT)引物與抗生物素蛋白及強(qiáng)力微磁球相連的mRNA。第51頁/共95頁第52頁/共95頁RNA的電泳檢測(cè)RNA的濃度和純度可通過測(cè)試其OD260來判斷，OD260為1時(shí)相當(dāng)于濃度為40μg/mL。檢測(cè)：瓊脂糖凝膠電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法。28S18S總RNA電泳條帶第53頁/共95頁第三節(jié)分子雜交

一、Southern雜交二、Northern雜交三、菌落原位雜交四、Western雜交第54頁/共95頁2023/3/2655分子雜交

(moleculehybridization)分子雜交是指在分子克隆中的一類核酸和蛋白質(zhì)分析方法，用已知標(biāo)記的核酸分子或蛋白質(zhì)分子檢測(cè)混合樣品中未知核酸分子或蛋白質(zhì)分子，以及其相對(duì)分子量大小。根據(jù)其檢測(cè)對(duì)象的不同可分為

Southern

雜交、Northern

雜交和

Western

雜交

，及由此簡(jiǎn)化的斑點(diǎn)雜交、狹線雜交和菌落雜交。

第55頁/共95頁2023/3/2656分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行，也可能在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間進(jìn)行。核酸分子雜交是指核酸分子(DNA或RNA)在變性以后，在復(fù)性的過程中兩個(gè)不同來源的且同源的核酸分子形成雜合雙鏈的過程。通過各種方法將核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性標(biāo)記的探針與被固定的分子雜交，經(jīng)顯影后顯示出目的DNA或RNA分子所處的位置。

第56頁/共95頁2023/3/2657第57頁/共95頁2023/3/2658一、Southern雜交

這種方法是E.M.Southern1975年建立,是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。第58頁/共95頁2023/3/2659（一）Southern雜交的操作步驟1.預(yù)處理：

（1）用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA進(jìn)行酶切。（2）將酶切后的DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。（3）將電流出來的那塊凝膠泡在強(qiáng)堿溶液中，此時(shí)雙鏈的DNA樣品變性成單鏈DNA結(jié)構(gòu)。（4）用酸中和，使單鏈DNA維持其單鏈狀態(tài)2.原位轉(zhuǎn)移：將凝膠上的單鏈DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。第59頁/共95頁2023/3/26603.固定：在真空烤箱里，80℃下烤1-3h。將核酸樣品進(jìn)一步固定在濾膜上4.雜交：雜交之前須有一個(gè)預(yù)雜交，封阻膜的背景，避免雜交時(shí)背景吸附探針。將濾膜移在含有放射性同位素標(biāo)記的探針分子溶液中，溶液上的單鏈DNA分子與探針分子通過互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行雜交，形成雜種分子。

第60頁/共95頁2023/3/26615.漂洗：

將濾膜上沒有和單鏈DNA樣品結(jié)合的游離的探針分子漂洗下來，此后濾膜上只有雜交分子。6.放射自顯影：

在X光曝射下進(jìn)行放射自顯影形成自顯影圖片。7.比較鑒定：

將放射自顯影圖片上的譜帶與凝膠上的譜帶進(jìn)行比較。確定與探針分子結(jié)合的DNA分子是凝膠上DNA鏈的那個(gè)片段。第61頁/共95頁2023/3/2662放射自顯影DNA印跡轉(zhuǎn)移探針雜交－＋第62頁/共95頁2023/3/2663SouthernBlotting的過程1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA2.通過電泳液的移動(dòng)轉(zhuǎn)移膠中的DNA3.固定膠中的DNA4.預(yù)雜交和雜交(放射性和熒光檢測(cè))5.結(jié)果檢測(cè)第63頁/共95頁2023/3/2664Southern印跡雜交方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果十分靈敏，在理想的條件下，應(yīng)用放射性同位素標(biāo)記的特異性探針和放射自顯影技術(shù)，即使每帶電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測(cè)出來。第64頁/共95頁2023/3/2665

1.硝酸纖維素濾膜在印跡技術(shù)中，硝酸纖維素濾膜是目前應(yīng)用最廣的一種固相支持物，但它存在一些不足之處:

（1）硝酸纖維素濾膜是依賴疏水性相互作用結(jié)合DNA的，這種結(jié)合并不十分牢固，隨著雜交及洗膜進(jìn)程，DNA會(huì)慢慢脫離硝酸纖維素濾膜，從而使雜交效率下降。（二）Southern雜交的雜交濾膜第65頁/共95頁2023/3/2666（2）硝酸纖維素濾膜質(zhì)地較脆弱，容易碎裂，因此操作須小心謹(jǐn)慎(特別是經(jīng)烘烤后)。（3）硝酸纖維素濾膜與核酸的結(jié)合有賴于高鹽濃度，在低鹽濃度時(shí)結(jié)合DNA效果不佳，不適宜于電轉(zhuǎn)印跡法。（4）硝酸纖維素濾膜對(duì)于小分子質(zhì)量的DNA片段(特別是小于200bp的DNA片段)結(jié)合能力不強(qiáng)。第66頁/共95頁2023/3/26672.尼龍膜優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合DNA和RNA的能力強(qiáng)于硝酸纖維素濾膜，對(duì)小分子質(zhì)量的核酸也能較好地結(jié)合。尼龍膜韌性強(qiáng)，操作較方便，對(duì)離子濃度要求不高，可重復(fù)用于雜交。缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底較硝酸纖維素濾膜高。第67頁/共95頁2023/3/2668

將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。二Northern雜交第68頁/共95頁2023/3/2669Northern雜交的過程①提取總RNA。②分離mRNA。利用親和層析的原理純化mRNA。③制備RNA探針。根據(jù)mRNA序列合成同源DNA探針，或以cDNA為探針。④Northern雜交。Northern雜交的方法包括點(diǎn)雜交和印跡雜交，兩者都能鑒定外源基因是否得到轉(zhuǎn)錄，但后者還能確定mRNA分子質(zhì)量大小及豐度。第69頁/共95頁2023/3/2670三菌落原位雜交

（colonyinsituhybridization）●1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根據(jù)檢測(cè)重組子DNA分子的核酸雜交技術(shù)原理,對(duì)Southern印跡技術(shù)作了一些修改,提出了菌落原位雜交技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)是直接把菌落印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上,經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來并與濾膜原位結(jié)合,再與特異性DNA探針雜交,篩選出含有插入序列的菌落。第70頁/共95頁2023/3/2671菌落原位雜交的操作步驟

第71頁/共95頁2023/3/2672第72頁/共95頁2023/3/2673四Western雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡和免疫測(cè)定結(jié)合在一起的檢測(cè)方法，具有很高的靈敏度，可從總蛋白中檢測(cè)出50ng的特異性表達(dá)蛋白。第73頁/共95頁2023/3/2674Step1.AntibodyRecognitionoftargetprotein/antigenStep2.SecondaryAntibodyrecognitionofprimaryAbStep3.ColorDevelopmentWestern雜交的操作步驟

第74頁/共95頁2023/3/2675WesternBlot檢測(cè)HIV第75頁/共95頁2023/3/2676◆

Southern印跡法(DNA印跡法,Southernblotting)：是一種把DNA電泳分離區(qū)帶轉(zhuǎn)移到支持膜上的技術(shù)。因這一技術(shù)是英國(guó)科學(xué)家E.M.Southern首先創(chuàng)建的，而且這一轉(zhuǎn)移過程與墨跡被吸印到吸墨紙上的過程相似，所以用他的姓氏命名為Southern印跡法。

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Northern印跡法(RNA印跡法,Northernblotting)：Alwine等人將Southern印跡法應(yīng)用于RNA，原理與Southern印跡法相似。Alwine等人根據(jù)命名Southern印跡法的姓氏中含有“南部”之意，風(fēng)趣地把他們的RNA印跡法稱為“北部”印跡法（Northernblotting）。

第76頁/共95頁2023/3/2677◆

Western印跡法（蛋白質(zhì)印跡法，Westernblotting）：是一種從混合蛋白質(zhì)中檢出微量特定蛋白質(zhì)的方法。人們把這種以電驅(qū)動(dòng)為轉(zhuǎn)移方式的蛋白質(zhì)印跡法詼諧地稱為“西部”印跡法（Westernblotting）。

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Eastern印跡法（Easternblotting）：也是一種蛋白質(zhì)印跡法，與Western印跡法不同之處是：先用等電聚焦-聚丙烯酰胺凝膠電泳（IEF）分離蛋白質(zhì)，然后也是將蛋白質(zhì)的分離區(qū)帶、以電驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)移方式進(jìn)行了印跡。這一方法又被稱為Easternblotting。第77頁/共95頁2023/3/2678一、RNA的S1核酸酶作圖：分析原mRNA加工剪接為成熟mRNA中的剪切區(qū)段和邊界。二、S1核酸酶作圖分析mRNA端點(diǎn)：5’和3’端均可分析。三、引物延伸法分析mRNA的端點(diǎn)：只能用于5’末端的作圖。第四節(jié)RNA作圖和端點(diǎn)分析第78頁/共95頁2023/3/2679第79頁/共95頁2023/3/2680第80頁/共95頁第五節(jié)重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞一

選擇受體細(xì)胞的基本原則二

重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌第81頁/共95頁2023/3/2682●

受體細(xì)胞(receptorcell)

又稱為宿主細(xì)胞或寄主細(xì)胞(hostcell)等，從實(shí)驗(yàn)技術(shù)上講是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞;從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價(jià)值和理論研究?jī)r(jià)值的細(xì)胞。

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感受態(tài)(competence)

細(xì)胞處于能夠吸收DNA的狀態(tài)，稱為感受態(tài)?！?/p>

感受態(tài)細(xì)胞(competentcell)

處于能夠吸收DNA狀態(tài)的細(xì)胞。第82頁/共95頁2023/3/2683●

細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來自另一種細(xì)菌菌株的DNA，而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程?！?/p>

轉(zhuǎn)化子(transformant)：經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)的細(xì)胞。第83頁/共95頁2023/3/2684●

轉(zhuǎn)化(transformation):指將質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌中的過程?！?/p>

轉(zhuǎn)染(transfection):指病毒及其重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程?！?/p>

轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):指噬菌體及其重組子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。第84頁/共95頁2023/3/2685一選擇受體細(xì)胞的基本原則1、便于重組DNA分子的導(dǎo)入。2、便于重組體的篩選。根據(jù)所用的表達(dá)載體所含的選擇性標(biāo)記與受體細(xì)胞基因是否相匹配，從而易于對(duì)重組體進(jìn)行篩選。3、遺傳穩(wěn)定性高，易于進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)或易于進(jìn)行高密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達(dá)效率。對(duì)動(dòng)物細(xì)胞而言，所選用的受體細(xì)胞具有對(duì)培養(yǎng)的適應(yīng)性強(qiáng)，可以進(jìn)行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

第85頁/共95頁2023/3/26864、受體細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)積累，可促進(jìn)外源基因高效分泌表達(dá)。5、安全性高，無致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成生物污染。一般選用致病缺陷型的細(xì)胞或營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞作為受體細(xì)胞。第86頁/共95頁2023/3/26876、能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。從受體細(xì)胞的角度出發(fā)，通常的做法是是對(duì)其作適當(dāng)?shù)男揎椄脑欤邕x用某