實(shí)驗(yàn)八PCR產(chǎn)品純化及定向克隆級(jí)

實(shí)驗(yàn)八PCR產(chǎn)品純化及定向克隆級(jí)第1頁/共11頁實(shí)驗(yàn)八

PCR產(chǎn)品純化及定向克隆一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)并掌握基因工程操作技術(shù)中最常用的DNA純化和連接方法；鞏固DNA酶切的操作。第2頁/共11頁二、實(shí)驗(yàn)原理

PCR產(chǎn)物一般都含有過量的引物、Taq酶及dNTP等成分，直接影響后續(xù)的基因操作，利用苯酚/氯仿、氯仿依次抽提反應(yīng)體系中的酶，然后在酸性條件下用乙醇沉淀DNA。根據(jù)實(shí)驗(yàn)六所用的PCR引物，其產(chǎn)品的5′和3′末端分別具有EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)，而載體pET32的多克隆位點(diǎn)中也有此兩個(gè)酶切位點(diǎn)。因此，若將PCR產(chǎn)物與載體分別用EcoRI和NotI進(jìn)行雙酶切，所得的產(chǎn)物相應(yīng)末端正好互補(bǔ)，可用T4DNA連接酶在體外進(jìn)行連接。第3頁/共11頁正向引物（P1）

EcoRI5’-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3’反向引物（P2）：

NotI5’-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3’第4頁/共11頁第5頁/共11頁三、實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑1、實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)二提取的質(zhì)粒載體pET32

實(shí)驗(yàn)七的PCR產(chǎn)品以及實(shí)驗(yàn)八的RT-PCR產(chǎn)品2、主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶：EcoRI和NotI

T4DNA連接酶苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿、醋酸鈉（pH5.2）、無水乙醇、70%乙醇等第6頁/共11頁四、實(shí)驗(yàn)步驟1、PCR產(chǎn)品的純化每組同學(xué)的PCR和RT-PCR產(chǎn)品合并，約130μl，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，向PCR產(chǎn)品中加入150μl苯酚/氯仿/異戊醇，旋渦混合，14000rpm離心5min；將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加入150μl氯仿，旋渦混合，14000rpm離心5min；再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加10μl醋酸鈉和250μl無水乙醇，混勻后，離心管插入冰中放置30min；在4℃下14000rpm離心10min，去除上清，觀察DNA沉淀。加20μl滅菌水溶解DNA，備用。第7頁/共11頁四、實(shí)驗(yàn)步驟2、PCR產(chǎn)品與載體pET32的雙酶切

分別在兩個(gè)1.5mL離心管中準(zhǔn)備雙酶切反應(yīng)混合液。A.10×Hbuffer5μlB.

10×Hbuffer5μl0.1%BSA5μl0.1%BSA5μl

EcoRⅠ2μlEcoRⅠ2μl

NotⅠ2μlNotⅠ2μl

PCR產(chǎn)品20μlpET32載體約2μg

滅菌蒸餾水16μl加滅菌蒸餾水至總體積50μl

將上述兩個(gè)離心管內(nèi)的混合物輕輕混勻，37℃水浴酶切3小時(shí)。第8頁/共11頁四、實(shí)驗(yàn)步驟3、酶切產(chǎn)品的純化

酶切后的PCR產(chǎn)品和載體合并(約100μl)，加入100μl苯酚/氯仿/異戊醇，旋渦混合，14000rpm離心5min；將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加入100μl氯仿，旋渦混合，14000rpm離心5min；再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加10μl醋酸鈉和250μl無水乙醇，混勻后，離心管插入冰中放置30min；在4℃下14000rpm離心10min，去除上清；加入500μl70%乙醇洗滌DNA沉淀，在4℃下14000rpm離心5min，去除上清，空氣干燥；加8μl滅菌水溶解DNA，備用。第9頁/共11頁四、實(shí)驗(yàn)步驟

4、目的基因(CaM5)與載體(pET32)的連接

在滅菌的PCR管中依次加入：

10×T4DNALigasebuffer1μl

T4DNALigase1μl

PCR產(chǎn)品和pET32