流動相的選擇

流動相的選擇采用“HPLC”級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對試樣有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配水的等級純化水蒸餾水去離子水因為不純物的存在，去離子的吸光率較高純化水中去除了無機和有機的污染物溶劑的等級HPLC級優(yōu)級純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45u的過濾(除纖維毛,未溶解的機械顆粒優(yōu)級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級經(jīng)過0.2u的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)溶劑的過濾濾膜類型：聚四氟乙烯濾膜：適用于所有溶劑，酸和鹽。醋酸纖維濾膜：不適用于有機溶劑，特別適用于水基溶劑。尼龍66濾膜：適用于絕大多數(shù)有機溶劑和水溶液，可以用于強酸，不適用于二甲基甲酰胺。再生纖維素濾膜：蛋白吸收低，同樣適用于水溶性樣品和有機溶劑脫氣：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡氣泡對測定的影響：1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動脫氣的目的防止由氣泡的產(chǎn)生引起的故障防止由溶解（在液體中的）氣體量的變動引起的檢測不穩(wěn)定程度1）示差折射率檢測器*使折射率變化2）UV檢測器（200nm以下）*溶解氧氣有吸收3）熒光檢測器*溶解氧氣有消光作用脫氣的方法1.超身波脫氣法2.He清除法3.使用氟樹脂膜的減壓脫氣法梯度洗脫法梯度洗脫裝置：高壓梯度：用兩臺高壓輸液泵將兩種溶劑輸入低壓梯度：在常壓下將兩種溶劑（或多元溶劑）混合，然后用高壓輸液泵將流動相輸入到色譜柱中。梯度洗脫：優(yōu)點：可提高分離度、縮短分離時間、降低最小檢測量和提高分離精度梯度洗脫法的注意點溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)性差梯度混合的溶劑互溶性要好梯度洗脫應使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）查看空白實驗的數(shù)據(jù)。遵守分析周期。（最初的分析數(shù)據(jù)不采用）樣品處理1.使用流動相溶解樣品--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時由為重要--保證樣品在流動相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀選擇緩沖液的步驟1.確定最佳分離狀態(tài)時的流動相pH2.選擇具有與流動相的pH相近的pKa的緩沖液（即使?jié)舛认∫簿哂休^強能力的緩沖液）3.確認檢測波長下緩沖液是否有大的吸收（在波長210nm附近進行檢測時，不能用醋酸和檸檬酸的緩沖液）一些代表性弱酸的pKapK1pK2pK3醋酸4.87檸檬酸3.134.766.40磷酸2.167.2112.32緩沖液的使用使用前必須過濾使用后一定要進行清洗，以免造成腐蝕、磨損、阻塞:用純水沖洗30-60min（1ml/min），再用甲醇沖洗30min易受到細菌和霉菌的影響管線選擇管線選擇不銹鋼TeflonPEEK(聚醚酮)尺寸0.1mmI.D.x1.6mmO.D.0.3mmI.D.x1.6mmO.D.0.5mmI.D.x1.6mmO.D.0.8mmI.D.x1.6mmO.D管線材料不銹鋼(可用于所有連接)能承受幾千kg/cm2壓力酸性或高濃度鹽環(huán)境中易腐蝕(尤其在pH小于2時)PEEK(可用于所有連接)能承受高達250kg/cm2壓力可在整個PH范圍(pH1-14)內(nèi)使用不適用于高溶解性溶劑如氯仿等Teflon(用于柱后阻尼管、反應管和排液管)化學惰性大能承受5kgf/cm2壓力液相色譜容易出問題的部件吸濾頭材料：不銹鋼燒結，孔徑10um故障：堵塞表現(xiàn)：管路中不斷有氣泡生成措施：用5％～20％的稀硝酸，超聲波清洗，再用蒸餾水清洗注意點：吸濾頭拆下時不必將塑料管剪斷單向閥故障1：寶石球粘附于墊片表現(xiàn)：泵無法吸液或排液，流路不通措施：1）用針筒抽出口單向閥以產(chǎn)生負壓，使寶石球與墊片分開2）拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超聲波清洗故障2：寶石球或塑料墊片受污導致密封不好表現(xiàn)：系統(tǒng)壓力波動大措施：拆下單向閥，放入異丙醇或水中，用超聲波清洗柱塞密封圈故障：密封圈磨損而導致密封不良現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或漏夜措施：更換密封圈注意點：更換密封圈拆卸泵頭前，柱塞桿復位（P－SET）線路過濾器故障：堵塞現(xiàn)象：系統(tǒng)壓力波動大或壓力偏高措施：5％稀硝酸，超聲波清洗判斷依據(jù)：關閉排液閥，斷開出口管路，設定流速1mL/min，如壓力>3kgf/cm2，則可能堵塞。進樣器自動進樣器手動進樣器原理：（六通閥）注入方式：1）全量注入2）部分注入手動進樣法便捷的方法（不需清洗）1.進樣狀態(tài)下插入微量注射器2.切到裝填狀態(tài)3.注入樣品4.切回到進樣狀態(tài)手動進樣器操作注意點：1）插針應插到底2）進樣應使用液相色譜專用平頭進樣針3）清洗應使用專用針口清洗器手動進樣閥故障：轉(zhuǎn)子密封損壞現(xiàn)象：漏液原因：a擰的太緊b樣品太臟c針頭損壞或不使用液相專用針解決措施：更換轉(zhuǎn)子密封，并在使用手動進樣閥故障：載樣困難原因：a定量環(huán)堵塞b進樣器污染解決措施：清洗或更換定量環(huán)、進樣器分析結果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測穩(wěn)定性柱子故障：系統(tǒng)高壓、峰型變差（拖尾峰、前沿峰、分叉峰），保留時間的改變解決措施：清洗正相柱，正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇反相柱